一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组β

【技术实现步骤摘要】
一种重组
β
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1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用


[0001]本专利技术涉及酶工程
，特别是涉及一种重组β
‑
1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用。

技术介绍

[0002]在自然生态系统中，纤维素是含量最丰富的有机化合物，也是植物组织细胞中的主要成分，一般占植物干重的30％
‑
50％。大量的秸秆、稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低，大多采用燃烧的方法来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。充分利用纤维素资源，将其有效转化成可利用的资源，对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等世界性难题都有着重大的意义。如果将纤维素以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功，那么纤维素资源便可成为人类食物、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。但目前有效利用纤维素生物质资源的主要障碍是纤维素酶的酶解效率十分低下，与淀粉酶相比相差2个数量级以上，进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高，约占纤维素糖化工艺的40％以上，从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。
[0003]纤维素酶是一类酶的总称，可以分为内切葡聚糖酶(endo
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1,4
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β
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D
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glucanase，EC3.2.1.4，即C1酶)、外切葡聚糖酶(1,4
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β
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D
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glucan cellobilhydrolase或exo
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1,4
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β
‑
D
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glucannase，EC.3.2.1.91)和β
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葡聚糖苷酶(β
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1,4
‑
glucosidase，BG，EC.3.2.1.21)。其中，内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶类，可以作用于纤维素分子内的无定形区，将长链纤维素分子水解成短链状，产生小分子纤维素，可以为外切酶提供大量的反应末端，同时还能水解小分子的纤维素寡糖。近年来，人们对纤维素酶的分子结构、功能性氨基酸和酶基因的克隆研究开展的比较多。相关研究显示，纤维素酶分子具有类似的结构，一般由球状的纤维素催化结构域(Catalyticdomains,CD)，纤维素结合结构域(Cellulose
‑
Binding Domsins,CBD)和连接桥(Linker)三部分组成。
[0004]酶的固定化，是指利用一些载体材料将酶束缚或者限制于一定的区域内，酶仍然能进行其特有的催化反应，并且能被回收和重复使用的一类技术。而所谓的固定化酶，是指在一定的空间内，呈闭锁状态，并仍然能保留其催化活力，可以连续或重复利用的酶。固定化细胞技术与固定化酶类似，细胞被固定化以后，可以继续存活，保持全细胞催化特性，而且固定化细胞对环境具有较高的耐受性，催化活性重复使用效率也较高。另外，固定化细胞比固定化酶成本低，可以反复生长使用，容易与反应体系分离。
[0005]但目前为止，尚未有利用固定化细胞技术对重组β
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1,4
‑
内切葡聚糖酶菌株进行固定化的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种重组β
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1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术所制备的重组β
‑
1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞具有
较好的稳定性，制备工艺合理，内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好，实现了β
‑
1,4
‑
内切葡聚糖酶的重复、高效利用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种重组β
‑
1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞，重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶菌株固定于海藻酸钠和钙盐形成的凝胶中。
[0009]进一步地，所述重组β
‑
1,4
‑
内切葡聚糖酶菌株为EG/BL21菌株；所述钙盐为CaCl2。
[0010]本专利技术还提供一种所述的重组β
‑
1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)将EG/BL21菌株进行活化、培养，收集菌液；
[0012](2)取菌液离心，用磷酸缓冲液将离心的菌体转移到质量百分比浓度为2
‑
6％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，取海藻酸钠菌体混合溶液，逐滴滴入质量百分比浓度为1
‑
3％的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置后滤出，用去离子水冲洗凝胶珠2
‑
3次，得到所述重组β
‑
1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞。
[0013]进一步地，所述活化具体为EG/BL21菌株接种到液体培养基，过夜培养；所述培养具体为活化后的EG/BL21菌株培养至OD
600
为1.0。
[0014]进一步地，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为3％。
[0015]进一步地，所述CaCl2溶液的质量百分比浓度为2％。
[0016]进一步地，步骤(2)中所述离心的菌体与海藻酸钠溶液的体积比为1∶40。
[0017]本专利技术还提供一种所述的重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞或所述的重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞的制备方法在纤维素糖化工艺中的应用。
[0018]进一步地，所述的重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞的培养pH为7.0。
[0019]进一步地，所述的重组β
‑
1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞的培养温度为45℃。
[0020]本专利技术公开了以下技术效果：
[0021]本专利技术利用海藻酸钠为主要基质，把重组β
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1,4
‑
内切葡聚糖酶菌株进行固定化，所制备的重组β
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1,4
‑
内切葡聚糖酶固定化细胞具有较好的稳定性，制备工艺合理，内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好，实现了β
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1,4
‑
内切葡聚糖酶的重复、高效利用，并且为重组β
‑
1,4
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内切葡聚糖酶菌株在纤维素水解中的应用奠定重要基础。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞，其特征在于，重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶菌株固定于海藻酸钠和钙盐形成的凝胶中。2.根据权利要求1所述的重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞，其特征在于,所述重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶菌株为EG/BL21菌株；所述钙盐为CaCl2。3.一种权利要求1
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2任一项所述的重组β
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1,4
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内切葡聚糖酶固定化细胞的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：(1)将EG/BL21菌株进行活化、培养，收集菌液；(2)取菌液离心，用磷酸缓冲液将离心的菌体转移到质量百分比浓度为2
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6％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，取海藻酸钠菌体混合溶液，逐滴滴入质量百分比浓度为1
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3％的CaCl2溶液中，形成凝胶珠，静置后滤出，用去离子水冲洗凝胶珠2
‑
3次，得到所述重组β

【专利技术属性】
技术研发人员：侯进慧，戴鹏飞，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：