一种壳聚糖酶的固定化方法技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶的固定化方法，该方法选用ESR

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖酶的固定化方法


[0001]本专利技术属于酶工程
，提供了一种壳聚糖酶的固定化方法。

技术介绍

[0002]壳聚糖酶(EC.3.2.1.132)是降解壳聚糖的专一性的酶，作用于壳聚糖的β
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1,4
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糖苷键分解为低分子量的壳寡糖。壳寡糖由于具有其独特的生物学功能在医药、农业、食品等领域有着广泛的用途，是当今国内外研究和开发的热点。
[0003]与传统酸降解或氧化降解的方法生产壳寡糖相比，利用生物酶法生产壳寡糖具有工艺简单、环境污染小，且产品分子量小、水溶性好和生物活性高等优点，因此越来越受到重视并且近年来也得到了很大发展。许多生产商采用纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等非专一性酶降解壳聚糖，但存在生产周期长、得率低等缺点；壳聚糖酶可专一性水解壳聚糖，能特异性作用于GlcN
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GlcN、GlcNAc
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GlcN、GlcNAc
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GlcNAc糖苷键，将壳聚糖水解成低分子量的壳寡糖，具有反应条件温和、无副反应、壳寡糖得率高、不造成环境污染等优点。
[0004]实际应用中使用游离壳聚糖酶存在如下缺点：酶的稳定性差，很容易受到pH值和温度的影响而变性失活；酶是水溶性的，反应后无法分离和回收重新利用，因此在生产工艺上往往有升高温度使酶失活的步骤，这不仅造成了成本的增加及能源的浪费，而且也增加了污染产品的机会，因此限制了产品的应用。应用固定化壳聚糖酶可以很好的解决上述问题，不仅可以解决酶回收和再利用、酶污染等问题，而且提高了酶的稳定性，使酶对酸、碱、高温等条件耐受性得到极大的提高，同时采用固定化酶催化，还可简化反应操作，使酶促反应可以实现连续化、自动化，因此固定化酶的研究开发具有极其重要的意义。
[0005]目前壳聚糖酶的固定化应用较多的方法有包埋法、吸附法、交联法等，然而这些吸附、交联或者是包埋固定化酶的量都很小，酶的活性损失都比较严重，即使有的酶活回收率达到80％，但是消耗的成本太高，另外包埋之后影响底物与酶活性位点的接触，增大了位阻；酶的半衰期及存活时间都比较短，稳定性低，导致很难在工业化生产中应用。
[0006]因此能否提供一种更为合适的壳聚糖酶固定化方法成为研究的难点和重点。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对上述技术存在的不足，提供一种壳聚糖酶的固定化方法，该方法选用ESR
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3作为载体树脂，利用交联剂戊二醛对载体树脂ESR
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3进行活化，然后再加入壳聚糖酶液，两者发生共价结合反应，最后加入还原剂硼氢化钠/钾进行处理，得到固定化壳聚糖酶；所获得的固定化壳聚糖酶可用于水解壳聚糖溶液来生产低分子量的水溶性壳寡糖；采用上述方法使壳聚糖酶固定化以后具有较高的贮藏和操作稳定性，酶与底物和产物易分离，利于酶的回收和重复利用等优点，适宜工业化应用。
[0008]本专利技术所选用的ESR
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3载体树脂，是专利技术人优选出的最佳载体树脂，专利技术人同时对大孔树脂，环氧基树脂和ESR
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2、ESR
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3、ESR
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5树脂进行固定化酶的试验后发现，ESR
‑
3固定化后的壳聚糖酶酶活力回收率高，且酶活活性高，该树脂购自天津南开和成科技有限公司，
该树脂上带有伯胺基功能基团，用其作为壳聚糖酶载体可以提高稳定性和酶活性，并以此为基础，提供了下述具体的固定化方法：
[0009]一种壳聚糖酶的固定化方法，步骤如下：
[0010](1)载体活化
[0011]称取一定量的树脂ESR
‑
3载体，加入缓冲液中，同时再加入一定浓度的交联剂，置于摇床上振荡，使之反应2
‑
5h；取出载体，缓冲液清洗树脂，以洗脱液中不含交联剂为标准，滤干备用；
[0012](2)壳聚糖酶的固定化
[0013]称取适量活化后的树脂载体，加入上述缓冲液，缓冲液用量以可以浸没过全部载体即可；再加入适量活力的壳聚糖酶酶液，混合均匀后，置于摇床上振荡至壳聚糖酶固载完成；滤出已经固载好壳聚糖酶的载体，分别用纯水和氯化钠溶液清洗，清洗完毕滤出载体，加入硼氢化钠/钾溶液，搅拌过滤，收集载体，检测酶活，即可获得固定化壳聚糖酶。
[0014]更进一步的，专利技术人提供的具体操作步骤如下：
[0015](1)载体活化
[0016]称取一定量的树脂ESR
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3载体，加入缓冲液中，同时再加入一定浓度的交联剂，置于摇床上振荡，使之反应2
‑
5h；取出载体，缓冲液清洗树脂，以洗脱液中不含交联剂为标准，滤干备用；
[0017]所述缓冲液为pH值>7.0的碱性缓冲液，其用量以可以浸没过全部载体即可，更具体的，可以限定缓冲液的用量为树脂载体质量与缓冲液的质量体积比为1g:0.8mL
‑
1g:10mL；
[0018]可选自磷酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸钠
‑
氢氧化钠缓冲液；
[0019]所述交联剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双重氮联苯胺
‑
2,2
’‑
二硫酸、六亚甲基异氰酸酯、1,5
‑
二氟
‑
2,4
‑
硝基苯砜、己二酰亚胺酸二甲酯中的一种，其用量为缓冲液体积用量的0.2
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5％；优选为戊二醛；
[0020]采用上述交联剂可以与ESR
‑
3树脂上带有伯胺基形成共价键，进而再与壳聚糖酶以共价键的形式结合，从而实现对壳聚糖酶的固定化；
[0021](2)壳聚糖酶的固定化
[0022]称取适量活化后的树脂载体，加入上述缓冲液，缓冲液用量以可以浸没过全部载体即可；
[0023]再加入适量活力的壳聚糖酶酶液(所述壳聚糖酶酶液活力为10
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300U/mL)，混合均匀后，置于摇床上振荡20h以上，其中树脂载体质量与壳聚糖酶酶液的质量体积比为1g:5mL
‑
1g:30mL；
[0024]滤出已经固载好壳聚糖酶的载体，纯水洗涤至茚三酮检测流出液呈阴性；最后用1mol/L氯化钠溶液洗至茚三酮检验呈阴性，滤出载体，加入硼氢化钠/钾溶液，搅拌15min后过滤，收集载体，检测酶活，即可获得固定化壳聚糖酶。
[0025]该步骤中缓冲液的用量为树脂载体质量与缓冲液的质量体积比为1g:0.8mL
‑
1g:10mL；
[0026]步骤(2)中所采用的硼氢化钠/钾溶液浓度为0.2mM
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0.5mM，用量为树脂载体质量与硼氢化钠/钾溶液的质量体积比为1g:2mL
‑
1g:10mL；
[0027]现有技术中，酶的固定化操作中一般是采用蒸馏水进行清洗，本申请采用硼氢化钠/钾溶液进行清洗，主要就是由于硼氢化钠/钾溶液具有较强的还原作用，可以使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶的固定化方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)载体活化称取一定量的树脂ESR
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3载体，加入缓冲液中，同时再加入一定浓度的交联剂，置于摇床上振荡，使之反应2
‑
5h；取出载体，缓冲液清洗树脂，以洗脱液中不含交联剂为标准，滤干备用；(2)壳聚糖酶的固定化称取适量活化后的树脂载体，加入上述缓冲液，缓冲液用量以可以浸没过全部载体即可；再加入适量活力的壳聚糖酶酶液，混合均匀后，置于摇床上振荡至壳聚糖酶固载完成；滤出已经固载好壳聚糖酶的载体，分别用纯水和氯化钠溶液清洗，清洗完毕滤出载体，加入硼氢化钠/钾溶液，搅拌过滤，收集载体，检测酶活，即可获得固定化壳聚糖酶。2.根据权利要求1所述的壳聚糖酶的固定化方法，其特征在于：步骤(1)中所述缓冲液为pH值>7.0的碱性缓冲液，其用量以可以浸没过全部载体即可；所述交联剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双重氮联苯胺
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2,2
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二硫酸、六亚甲基异氰酸酯、1,5
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二氟
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2,4
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硝基苯砜、己二酰亚胺酸二甲酯中的一种，其用量为缓冲液体积用量的0.2
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5％。3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖酶的固定化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的碱性缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸钠
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氢氧化钠缓冲液中的一种；所述交联剂为戊二醛。4.根据权利要求1所述的壳聚糖酶的固定化方法，其特征在于：步骤(2)中加入适量活力的壳聚糖酶酶液，混合均匀后，置于摇床上振荡20h以上；其中树脂载体质量与壳聚糖酶酶液的质量体积比为1g:5mL
‑
1g:30mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：司更花，马韵升，杨传伦，孙建忠，王红霞，王秀芝，梁敬敬，
申请(专利权)人：黄河三角洲京博化工研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：