一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用。本发明专利技术的牛源轮状病毒重组VP8蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术重组VP8蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，能够在原核系统中高效表达，本发明专利技术的亚单位疫苗可以产生较高水平的中和抗体，适用于作为轮状病毒亚单位疫苗。位疫苗。位疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种牛轮状病毒重组VP8蛋白与应用。

技术介绍

[0002]A群轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)是一种人畜共患病毒，是导致全世界儿童与幼畜急性腹泻的重要病原体。牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)可通过粪口途径和呼吸道途径传播，给全世界养牛业带来巨大的经济损失，在中国，根据多个学者的研究表明BRVA在我国腹泻犊牛中的检出率为21.4％～90.91％。RV VP4决定轮状病毒的P基因型。迄今为止，51个P型已经被发现，在BRVA中证实了14个P型的存在，P[1]、P[5]、P[11]基因型在BRVA中最为常见。在我国牛群中检测出的P型有P[1]、P[5]、P[7]、P[11]，其中G6P[1]型BRVA在我国牛群中广泛流行。2019～2020年也有学者研究证实了我国青藏高原地区牦牛源BRV与我国部分省奶牛源BRV优势基因型为G6P[1]型，且牦牛源与奶牛源BRV遗传关系最近，表明了G6P[1]型BRV在我国牦牛与奶牛中广泛传播。
[0003]BRV的VP4蛋白由第4节段基因编码，全长约为2356bp，完整ORF为2331bp，共编码776个氨基酸。VP4蛋白能诱导机体产生中和抗原，是BRV的重要保护性抗原之一。在胰蛋白酶的作用下，VP4蛋白可裂解为VP8亚基(氨基酸位置：1～231)和VP5亚基(氨基酸位置：248～776)，VP8蛋白具有VP4蛋白的主要抗原表位，且决定着VP4蛋白的特异性血清中和反应。目前，已经鉴定出VP8亚基中的4个中和表位(8
‑
1，8
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2，8
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3和8
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4)，其特异性中和抗体在轮状病毒株之间显示出有限的交叉中和作用。因此VP8基因为牛轮状病毒亚单位疫苗重要靶基因。有研究发现人源RV VP8蛋白可诱导病毒中和抗体和小鼠相关保护，细菌表达的VP8蛋白可诱导高水平的病毒中和抗体，具有可观的疫苗潜力。
[0004]目前治疗轮状病毒尚无特效药物，一般通过提高环境卫生、提供清洁的水源来进行预防，但仅仅依靠上述方法并不能降低发病率和阻止病毒的传播。且现已经上市的轮状病毒疫苗均为减毒活疫苗，有较高的肠套叠风险，因此，开发出一种更加安全有效、能够避免毒力复壮和散毒的风险的牛轮状病毒亚单位疫苗具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种牛轮状病毒G6P[1]型重组VP8蛋白及其应用，该重组蛋白特异性高，可溶性表达易纯化制备、成本低，可作为抗原能够刺激机体产生中和抗体抗体，适用于制备治疗和/或预防轮状病毒的亚单位疫苗。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种牛轮状病毒VP8重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种编码权利要求1所述重组蛋白的基因。
[0009]进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术的第三目的在于提供一种重组表达载体，是采用上述基因优化得到。
[0011]进一步地，所述优化得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0012]进一步地，所述核苷酸序列中在5
’
端有酶切位点Nde I，3
’
端有酶切位点Xho I，N端有His标签。
[0013]本专利技术在构建表达载体时，在已知基因序列的情况下，利用生物软件对基因序列进行了大肠杆菌偏爱密码子优化，将改造后的序列全序列合成，无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率。
[0014]进一步地，所述重组表达载体为原核表达载体，用于原核重组表达系统。
[0015]所述原核表达载体包括但不限于pJLA50X系列、pET系列、pQE系列、pMAL系列、pGEX系列、pBAD系列载体中的一种，在本专利技术的具体实施方式中，所述原核表达载体为pET系列，进一步为pET30a表达载体。
[0016]进一步地，所述原核重组表达系统的制备方法，包括如下步骤：用上述的重组表达载体转化至大肠杆菌细胞，在LB液体培养基中培养，IPTG诱导表达获得重组蛋白。
[0017]本专利技术的表达菌株培养方式简单，培养周期短，可在几天时间内合成大量重组蛋白。
[0018]本专利技术通过原核表达系统可以在短期内获得大量优良的重组蛋白，抗原蛋白通过原核表达系统表达成可溶性表达，可溶蛋白无需在变性条件下纯化，弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，以及减少了复性步骤，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。
[0019]本专利技术的第四目的在于提供一种上述重组蛋白、上述基因、上述重组表达载体在制备预防和/或治疗轮状病毒引起的动物腹泻的疫苗中的应用。
[0020]进一步地，所述疫苗为亚单位疫苗。
[0021]进一步地，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂，进一步为201佐剂。
[0022]本专利技术具有如下有益效果：
[0023](1)本专利技术优化后的重组蛋白特异性高，易纯化制备、成本低，可作为抗原能够刺激机体产生高水平的中和抗体，适用于制备轮状病毒疫苗。
[0024](2)本专利技术将优化后的G6P[1]型重组VP8蛋白引入轮状病毒亚单位疫苗中，大大的提高了疫苗的免疫效力，得到的疫苗中和效价高，可实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。
[0025](3)本专利技术优化后的蛋白是非复制型的，在机体内不增殖，不存在散毒危险，安全性高。
附图说明
[0026]图1是本专利技术牛轮状病毒优化重组VP8基因的重组表达质粒pET
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30a
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VP8鉴定图；
[0027]图2是本专利技术优化后的牛轮状病毒优化重组VP8基因蛋白表达分析图；
[0028]图3是本专利技术纯化的牛轮状病毒优化重组VP8基因蛋白SDS
‑
PAGE电泳结果图；
[0029]图4是本专利技术牛轮状病毒优化重组VP8基因蛋白的Western blot检测图；
[0030]图5是间接ELISA方法检测兔血清抗体消长曲线图。
[0031]图1中，其中M表示DNA标准DL2000，1表示基因扩增产物；图2中，M表示蛋白分子质量标准，1表示诱导前总蛋白，2表示20℃上清，3表示20℃沉淀，4表示37℃上清，5表示37℃沉淀；图3中，M表示蛋白分子质量标准，1表示上样液，2表示流出液，3表示20mmol/L Imidazole洗脱组分，4表示50mmol/L Imidazole洗脱组分，5表示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛轮状病毒VP8重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述重组蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，是采用权利要求2或3所述基因优化得到。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述优化得到的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；进一步地，所述核苷酸序列中在5
’
端有酶切位点Nde I，3
’
端有酶切位点Xho I，N端有His标签。6.根据权利要求4所述的重组表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤承，岳华，王远微，姜晓明，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：