一种核酸酶活性提高的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种核酸酶活性提高的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体，以分子伴侣skp修饰的AmPR

【技术实现步骤摘要】
一种核酸酶活性提高的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶催化和基因工程领域，具体涉及一种蒙古黄芪病程相关蛋白突变体及其应用。

技术介绍

[0002]病程相关蛋白(pathogenesis
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related protein,PR)是植物在遭受病原菌侵害或外界环境压力下产生的一种抗逆的、有利于自身生长发育的蛋白质，分为17个家族，其中PR
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10类蛋白具有核酸酶活性，被认为与降解RNA类病毒有关(温韵洁,何卫红,黄群声.病程相关蛋白10在植物防御反应中的作用，植物生理学通讯[J].2008.44(3):585
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592)。蒙古黄芪病程相关蛋白(Astragalus membranaceus pathogenesis
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related protein
‑
10，AmPR
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10)由158个氨基酸残基组成，分子大小约为16.8kDa，目前已有研究证明无论是天然提取的AmPR
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10或是重组蛋白，都具有核酸酶活性，但是活力均偏低，不利于进行更深入的研究及大范围的应用。
[0003]酶分子的定向进化观点是由美国科学家Arnold FH于1993年首先提出，技术理念是通过模拟自然进化机制，对酶基因进行体外修饰，产生基因多样性，利用高通量筛选技术，获得具有预期特性的修饰酶。定向进化可利用多种手段诱导目的基因碱基发生增添、缺失、替换等突变，代表性的方法为易错PCR。该过程不需要对蛋白质的结构有充分的了解，目前该项技术已经在获得高活性的几丁质酶A、γ谷氨酰转移酶、β
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1,4
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葡聚糖内切酶等方面获得了应用。目前尚没有通过易错PCR筛选AmPR
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10突变的报道。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术通过以分子伴侣skp修饰的AmPR
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10全基因skp
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AmPR
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10为研究对象，利用易错PCR进行定向进化，得到了核酸酶活性更高的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体。
[0005]具体地，本专利技术提出了一种核酸酶活性提高的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ D NO.1。
[0006]其中，所述突变体以skp
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AmPR
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10作为目的基因通过易错PCR进化后得到，其中skp
‑
AmPR
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10的核苷酸序列为SEQ D NO.2。
[0007]本专利技术进一步提出了编码上述蒙古黄芪病程相关蛋白突变体的基因，其核苷酸序列为SEQ D NO.3。
[0008]进一步地，本专利技术提出了一种重组表达载体，其包括上述编码基因和表达载体。
[0009]优选地，所述表达载体为pET30a。其特征在于，其包含上述重组表达载体。
[0010]其中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主菌。
[0011]本专利技术还提出了上述重组菌在提高蒙古黄芪病程相关蛋白的可溶性蛋白表达量和核酸酶活性上的应用。
[0012]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0013](1)本申请以分子伴侣skp修饰的AmPR
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10全基因skp
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AmPR
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10为研究对象，这一策略使分子伴侣skp分担了进化过程中的突变压力，可以避免仅以AmPR
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10为目的基因时，进化范围(基因片段)较小而造成易死突变的现象，并且在一定程度上推迟进化平台期的出现，增加突变的多样性；
[0014](2)通过易错PCR定向进化技术构建突变文库，以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法，筛选核酸酶活性提高的AmPR
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10突变体，其核酸酶活性比野生型提高45％，测序结果显示该突变体基因序列465位增加了一个碱基A，进而由移码突变引起了多肽序列的提前终止，使得突变体A4缺失了末端3个氨基酸(156至158位)，从空间上看，这一变化减小了AmPR
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10三级结构中C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用，有利于目的蛋白与配体或底物的结合；
[0015](3)本专利技术的结果对AmPR
‑
10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义，为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定理论基础。
附图说明
[0016]图1为不同Mn
2+
浓度条件下目的基因扩增结果；
[0017]图2为野生型蛋白及突变体A4蛋白表达及纯化电泳检测结果；
[0018]图3为野生型蛋白及突变体A4基因测序结果；
[0019]图4为生型蛋白和突变体A4空间结构示意图，其中，(A)为野生型蛋白三级结构示意图，(B)为突变体A4蛋白结构示意图，缺失末端3个氨基酸。
具体实施方式
[0020]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，实施例将有助于理解本专利技术，但是本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。
[0021]下述实施例中使用的重组子pET30a
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skp
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AmPR
‑
10由山西中医药大学基础医学院克隆合成，感受态细胞E.coli BL21、质粒提取试剂盒、超级感受态制备试剂盒、蛋白纯化试剂盒、96孔细菌培养板，2
×
Taq PCR Master Mix购于生工生物工程(上海)有限公司；RIPA蛋白裂解液购于合肥博美生物科技有限责任公司；限制性内切酶Ncol、Xhol，T4DNA连接酶购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
[0022]实施例1蒙古黄芪病程相关蛋白突变体的制备。
[0023](1)目的基因skp
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AmPR
‑
10的易错PCR。
[0024]重组子pET30a
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skp
‑
AmPR
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10构建过程中基因skp、AmPR
‑
10的扩增，引物的设计，重组子的克隆过程，目的蛋白的诱导表达等方法均已公开发表(CN202010667955.8；王珏，胡丽丽，李桂兰.蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR
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10于大肠杆菌不同载体的可溶性表达策略研究[J].生物技术进展,2021,11(2):231
‑
237)，此处不再赘述。
[0025]以重组子pET30a
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skp
‑
AmPR
‑
10的质粒为易错PCR模板，我们在PCR体系中添加不同浓度的Mn
2+
(0mmol、0.1mmol、0.2mmol、0.3mmol、0.4mmol、0.5mmol)以确定合适的突变率。
[0026]以skp
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AmPR
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10作为目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸酶活性提高的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ D NO.1。2.根据权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体，其特征在于，所述突变体以skp
‑
AmPR
‑
10作为目的基因通过易错PCR进化后得到，其中skp
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AmPR
‑
10的核苷酸序列为SEQ D NO.2。3.编码权利要求1所述的蒙古黄芪病程相关蛋白突变体的基因，其核苷酸序列为SEQ D ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王珏，
申请(专利权)人：山西中医药大学，
类型：发明
国别省市：