添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法技术

本发明专利技术公开了添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，该方法为：将法夫酵母种子液接入添加了纳米二氧化钛的无菌发酵培养基中进行发酵培养，发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，从而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术通过调节添加不同浓度的纳米二氧化钛，从而有效的激发了法夫酵母的应激反应，产生了细胞膜内外的pH梯度，提高了虾青素的产量。该高产虾青素在用作保健品，药物原料，化妆品，动物饲料，增加免疫力，抗氧化性，营养性等方面具有重大的意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法


[0001]本专利技术涉及生物发酵
，具体涉及添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法。

技术介绍

[0002]虾青素（Astaxanthin）化学名称为3,3
′‑
二羟基
‑
4,4
′‑
二酮基
‑
β,β
′‑
胡萝卜素，分子式为C
40
H
52
O4，相对分子质量为596.86，属酮式类胡萝卜素，是一种萜烯类不饱和化合物。晶体状虾青素为粉红色，熔点215
‑
216℃ ，不溶于水，具脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、苯等大部分有机溶剂。虾青素分子结构中的共轭双键链，及共轭双键链末端的不饱和酮基和羟基，能吸引自由基未配对电子或向自由基提供电子，从而清除自由基，起抗氧化作用，该结构也使其易与光、热、氧化物发生作用，结构改变后降解为虾红素。虾青素化学结构式如图1所示。
[0003]虾青素主要以游离态和酯化态两种形式存在。游离态虾青素极不稳定，易被氧化，通常化学合成的虾青素为游离态形式。酯化态虾青素是由于虾青素末端环状结构中各有一个羟基易于与脂肪酸形成酯而稳定存在，水生动物皮肤和外壳上的虾青素以脂化态形式为主，肉及内脏上则以游离形式为主，红酵母、雨生红球藻中虾青素主要以酯化形式存在。
[0004]虾青素具有强大的抗氧化性。动物实验表明，虾青素可以去除NO2、硫化物、二硫化物，也可降低脂质过氧化作用，有效地抑制自由基引发的脂质过氧化。同时具有抗癌活性，能显著影响动物的免疫功能，强化需氧代谢，明显增强人的肌肉力量和耐受力，具有抗感染活性。在饲料工业中，虾青素主要用作鱼类（鲑鱼、鲟鱼、虹鳟鱼、真鲷等）和虾蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂。虾青素可以有效保护水产动物的肝胰腺等，使水生动物呈现健康鲜艳的色泽。虾青素在防治鱼类、虾蟹及禽类疾病方面有着强大的功用，可提高免疫力、提高成活率，对其正常生长和健康养殖、提高存活率及繁殖率具有重要的作用。虾青素还能够增加鱼类的风味，其可直接作为形成鲑鱼、鲥鱼等食品风味的前体化合物，也可促进脂肪酸或其他脂类前体物转化成鲑鱼的风味化合物。在家禽饲料中添加虾青素可增加鸡蛋蛋黄色素含量，它还可以提高母鸡的产蛋率，促进蛋鸡的健康。
[0005]目前虾青素的生产主要有化学合成和微生物合成提取两种方式，化学合成的虾青素不仅价格昂贵，而且分子结构生物学功能、应用效果及生物安全性能方面和天然虾青素存在显著差异。目前，使用微生物发酵合成提取虾青素的方法逐渐占据主导地位。自然界的虾青素来源于藻类、细菌、浮游植物。一些水生物种包括虾蟹在内的甲壳类动物，由于长期食用这些藻类、细菌和浮游植物而外表呈现红色，它们又被三文鱼、加力鱼等鱼类，火烈鸟、鸡、鸭等鸟类、家禽捕食，色素储存在皮肤和脂肪组织中使它们的皮肤和羽毛也呈现红色。 研究发现很多种类的藻类如雪藻、衣藻、裸藻、伞藻等都含有虾青素，其中雨生红球藻对虾青素的积累量比其它绿藻类高，是目前公认生产天然虾青素很好的生物来源。而细菌由于受其自身因素的影响，利用价值较低。法夫酵母被认为是目前真菌发酵生产中最为合适的虾青素来源。从法夫酵母中提取虾青素是生产虾青素的主要途径之一。
[0006]法夫酵母是天然可产虾青素的酵母，其反式虾青素已于2000年获得FDA批准，用于食品添加剂。法夫酵母以单细胞为主，有时形成假菌丝，繁殖方式为无性繁殖的芽殖，无有性繁殖，细胞中不但含有丰富的蛋白质、脂类、维生素，而且还含有大量的不饱和脂肪酸及多种虾青素的前体，其生长的温度范围0—27℃。法夫酵母生产虾青素的特点是：法夫酵母不需要光照，能利用多种糖作为碳源进行快速异养代谢，发酵周期短，生产速度快，能够在发酵罐中实现高密度培养，以及色素提取后菌体单细胞蛋白可作为饵料、饲料添加剂等。
[0007]微生物如酵母，或者大肠杆菌，可以使用葡萄糖或者油脂等能量物质，在体内合成虾青素。法夫酵母体内虾青素的合成途径示意图如图2所示。微生物在摄入葡萄糖（Glucose）或者其他能量物质后，会转化成关键代谢中间体乙酰辅酶A（Acetyl
‑
CoA），通过甲羟戊酸途径（MVA）合成异戊二烯焦磷酸（IPP），IPP在相关酶的作用下通过缩合反应生成法尼基焦磷酸（FPP），两分子FPP可以进一步缩合生成垅牛儿垅牛儿焦磷酸（GGPP），两分子GGPP进一步缩合生成八氢番茄红素（Phytoene），八氢番茄红素再经过脱氢和环化生成β
‑
胡萝卜素，再经过氧化作用，酮基化和羟基化生成终产物虾青素（Astaxanthin）。
[0008]值得注意的是，自然条件下培养的法夫酵母菌株体内虾青素产量低，且容易退化，不可能实现工业化生产。因此，使用各种诱变方法提高虾青素产量成为了研究的首选目标。目前采用的方法有紫外线诱变法，高能射线诱变法，化学试剂诱变法，基因工程改造法等。比如Gong 2012 （Gong, J., Duan, N., Zhao, X., 2012. Evolutionary engineering of Phaffia rhodozyma for astaxanthin
‑
overproducing strain. Front. Chem. Sci. Eng. 6 (2), 174
–
178.）这篇文献中，提到了在法夫酵母培养基中添加氧化物如二氧化钛（TiO2）可以诱变使得酵母产生应激反应，从而过表达某些特定基因以增产虾青素。虽然文献报道了添加二氧化钛可以促进法夫酵母生产虾青素的研究，可是文献中提到的二氧化钛固体颗粒尺度只是微米级别，在发酵期间微米级二氧化钛无法高效送达至酵母细胞体内，因此该文献所报道方法培养的法夫酵母体内的虾青素含量较低。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种能有效促进法夫酵母高产虾青素的方法。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，该方法为：将法夫酵母种子液接入添加了纳米二氧化钛的无菌发酵培养基中进行发酵培养，发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，从而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行。
[0011]进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：无菌发酵培养基中按300～500mg/L的添加量添加纳米二氧化钛，二氧化钛固体颗粒大小为40～80纳米，无菌发酵培养基的pH值保持为5.2～7.8，发酵期间法夫酵母细胞内的pH值比细胞外的pH值低，并使发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在
‑
2.6～
‑
1.9。
[0012]进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：法夫酵母种子液的制备方法如下：将法夫酵母接入种子培养基中进行发酵制备法夫酵母种子液，其中，种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其特征在于：该方法为：将法夫酵母种子液接入添加了纳米二氧化钛的无菌发酵培养基中进行发酵培养，发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，从而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行。2.根据权利要求1所述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其特征在于：无菌发酵培养基中按300～500mg/L的添加量添加纳米二氧化钛，二氧化钛固体颗粒大小为40～80纳米，无菌发酵培养基的pH值保持为5.2～7.8，发酵期间法夫酵母细胞内的pH值比细胞外的pH值低，并使发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在
‑
2.6～
‑
1.9。3.根据权利要求2所述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其特征在于：法夫酵母种子液的制备方法如下：将法夫酵母接入种子培养基中进行发酵制备法夫酵母种子液，其中，种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，种子培养基的组成成分包括：1～3%的葡萄糖、1～3%的酵母抽提物、1～2%的蛋白胨。4.根据权利要求1所述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其特征在于：无菌发酵培养基中所添加的纳米二氧化钛为经溶胶凝胶法处理的硬脂酸表面修饰的亲油性纳米二氧化钛。5.根据权利要求4所述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其特征在于：溶胶凝胶法处理硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛的处理方法如下：将10
±
20%克硬脂酸溶于50
±
20%毫升丙酮溶液中，然后加入5
±
20%克的纳米二氧化钛和50
±
20%毫升的蒸馏水，纳米二氧化钛固体颗粒大小为40～80纳米，将温度升至60
±
20%
o
C后搅拌反应1
±
20%小时后，用旋转蒸发仪蒸干该混合液后得到胶状物；然后将该胶状物用无水乙醇彻底洗涤后真空干燥后即得到粉末状的硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡鹏，张小芳，李勇，
申请(专利权)人：苏州吉态来胺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：