一种壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB和应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB和应用，其中突变体CsnB通过优化密码子后的壳聚糖酶Csncv突变得到，优化的壳聚糖酶Csncv氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.16

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB和应用。

技术介绍

[0002]壳寡糖作为一种生物刺激素在绿色农业种植发挥着重要作用，研究和实际应用表明，壳寡糖能够增加作物产量，提高农产品品质，提高作物抗病性、激活植物自身先天性免疫系统、提升作物抗逆性等功效。目前壳寡糖的制备主要分为化学法以及酶法。化学法由于存在废水污染环境、产物结构不完整等缺点，限制了其在壳寡糖制备领域的应用。相比于化学法，酶法制备壳寡糖过程具备反应条件温和、产物结构完整、过程易于控制、对环境无污染等优点，因此酶法被公认为主流的壳寡糖的生产和加工工艺，但现有的酶解工艺制备的壳寡糖产物的生理活性较低，且需要严格控制酶解反应时间，才能获得高聚合度寡糖比例较高的酶解产物，因此对生产工艺及设备控制要求较高。
[0003]为了更好的利用壳聚糖酶，对其进行开发和改造，目前，壳聚糖酶根据基因序列相似性分为5家族、7家族、8家族、46家族、75家族、80家族等，关于46家族壳聚糖酶的研究最多，包括对其三维结构和催化机理等研究较为深入，如王亚妮对两种46家族壳聚糖酶的复合物结构进行了解析，并获壳聚糖突变体，水解壳聚糖获得的壳寡糖产物中较高聚合度的比例含量有所提高（王亚妮，GH46家族壳聚糖酶的结构解析与催化机理研究）；中国专利113493781A公开了一种壳聚糖酶CsnH，其壳聚糖酶产量为665.3U/mL，最适反应温度为70℃，具有较好的耐热稳定性，水解产物未壳二糖；中国专利105602921公开了一种壳聚糖酶EAG1，45℃下水解4小时的产物为壳寡糖2~8糖，水解率也相应地有所提高；中国专利111235131公开了一种壳聚糖酶，其在pH 10和50℃时其相对酶活为898 .6U/mg，水解产物为成GlcN
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(GlcN)4；由此可见，壳聚糖酶专一性较高，且适用范围并不相同，另一方面，在公开的46家族中报道最多的为芽孢杆菌壳聚糖酶和链霉菌壳聚糖酶，而其它来源的壳聚糖酶则研究相对较少。因此，基于结构信息进行有针对性的定点突变，得到催化活性高，适应性广的壳聚糖酶，并利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌，对探索和丰富壳聚糖酶以及工业化生产具有重要意义。

技术实现思路

[0004]为了解决现有的技术问题，本专利首先重组表达紫色杆菌CV1192壳聚糖酶，通过分析测定发现，该壳聚糖酶具有产业化应用的价值，但是该酶热稳定性较差，当处理温度大于55℃时，容易变性失活，限制了其产业化应用，因此，本专利技术的主要目的在于如何提高壳聚糖酶的热稳定性，进一步用于壳寡糖的制备以及壳聚糖酶产业化应用。
[0005]本专利技术的首要目的在于提供密码子优化的紫色杆菌壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB；所述突变体CsnB由优化后的壳聚糖酶Csncv突变得到，包括V105Q、G134N、G240I、
G240I/G134N、G240I/V105Q、G134N/V105Q或G240I/G134N/V105Q，所述突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~7所示，所述突变体的基因序列分别如SEQ ID NO.8~14所示；SEQ ID NO.1V105Q氨基酸序列QGSTAGSPERQAVRLPDCAAAWSPASPYQAGSVASRGGVNYTAAFWTQGNPPEQGQAWQAGKRCRPAAQAKAADHDANFPPATLKFLKANTGLDGEQWDNIMKLQNKPEQDSLEWTKFYGYCENIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDASSGASNPSITGGLARAGVHGSMQGKILKISDSAKVFCDKIGNLQNNPAWRDAMWNTFYKVYIQYSVQQARQRGFSSALTIGSFVDTALNQGATGDSGTLQGLLSRSGNSGDEKTFMTAFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVQKVTNWEMK
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SEQ ID NO.2G134N氨基酸序列QGSTAGSPERQAVRLPDCAAAWSPASPYQAGSVASRGGVNYTAAFWTQGNPPEQGQAWQAGKRCRPAAQAKAADHDANFPPATLKFLKANTGLDGEQWDNIMKLVNKPEQDSLEWTKFYGYCENIGDKRGYTINIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDASSGASNPSITGGLARAGVHGSMQGKILKISDSAKVFCDKIGNLQNNPAWRDAMWNTFYKVYIQYSVQQARQRGFSSALTIGSFVDTALNQGATGDSGTLQGLLSRSGNSGDEKTFMTAFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVQKVTNWEMKSEQ ID NO.3G240I氨基酸序列QGSTAGSPERQAVRLPDCAAAWSPASPYQAGSVASRGGVNYTAAFWTQGNPPEQGQAWQAGKRCRPAAQAKAADHDANFPPATLKFLKANTGLDGEQWDNIMKLVNKPEQDSLEWTKFYGYCENIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDASSGASNPSITGGLARAGVHGSMQGKILKISDSAKVFCDKIGNLQNNPAWRDAMWNTFYKVYIQYSVQQARQRGFSSALTIISFVDTALNQGATGDSGTLQGLLSRSGNSGDEKTFMTAFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVQKVTNWEMKSEQ ID NO.4G240I/G134N氨基酸序列QGSTAGSPERQAVRLPDCAAAWSPASPYQAGSVASRGGVNYTAAFWTQGNPPEQGQAWQAGKRCRPAAQAKAADHDANFPPATLKFLKANTGLDGEQWDNIMKLVNKPEQDSLEWTKFYGYCENIGDKRGYTINIFGATTGGPNDEGPDGPTLFKEFDASSGASNPSITGGLARAGVHGSMQGKILKISDSAKVFCDKIGNLQNNPAWRDAMWNTFYKVYIQYSVQQARQRGFSSALTIISFVDTALNQGATGDSGTLQGLLSRSGNSGDEKTFMTAFYAQRSKIVDTNDYNQPPNGKNRVKQWSTLLNMGETDLKNADAAVQKVTNWEMK
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SEQ ID NO.5G240I/V105Q氨基酸序列QGSTAGSPERQAVRLPDCAAAWSPASPYQAGSVASRGGVNYTAAFWTQGNPPEQGQAWQAGKRCRPAAQAKAADHDANFPPATLKFLKANTGLDGEQWDNIMKLQNKPEQDSLEWTKFYGYCENIGDKRGYTIGIFGATTGGPNDEGPDGPTL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶突变体CsnB，其特征在于，所述突变体为V105Q、G134N、G240I、G240I/G134N、G240I/V105Q、G134N/V105Q或G240I/G134N/V105Q，所述突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~7所示。2.根据权利要求1所述的壳聚糖酶突变体Cs...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，祝木金，王平，陈微，钟斌，余思，曹革，
申请(专利权)人：深圳润康生态环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：