一种外泌体HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种外泌体HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒。所述试剂盒包括磁珠悬液、HER2抗体反应液、洗涤液、发光激发液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体抗体；所述HER2抗体反应液包括HER2抗体、二抗抗体、化学发光标记物，其中化学发光标记物与二抗抗体偶联，HER2抗体上的多个抗原表位与二抗抗体进行特异性结合。本发明专利技术的化学发光标记物优选为吖啶酯，反应液中一个HER2抗体可以结合多个二抗抗体，形成磁珠CD系列抗体

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种外泌体HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒。

技术介绍

[0002]外泌体(exosome)是一种30
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150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞
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融合
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外排”等一系列调控过程而形成。外泌体在被发现后的很长一段时间内都没有引起研究者的注意，直到纳米分析技术的引进，以及2013年诺贝尔生物医学奖的公布，这个直径只有几十纳米的颗粒受到了前所未有的重视。外泌体中含有的内容物如DNA、RNA、蛋白质和信号复合物在受体细胞基因和蛋白表达调控中有重要作用。
[0003]人类表皮生长因子受体2（HER2）是一种由ERBB2基因编码的蛋白质，参与导致细胞生长和分化的信号传导途径。HER2基因是影响乳腺癌预后的一个重要因素，15%
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20%乳腺癌患者肿瘤过度表达HER2，这类的肿瘤生长速度较快且生物行为较为恶性，使得手术后复发率高于其他类型的乳腺癌，而且对部分化学治疗药物也容易有抗药性，造成病患比较差的预后。近年来随着曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等乳腺癌抗HER2治疗分子靶向药物的不断出现，HER2阳性乳腺癌患者的预后进一步得到提高。HER2检测结果的判读标准、检测的技术路线、内外部质量控制等，对提高我国乳腺癌HER2检测的标准化水平起到了积极推动作用，随着HER2靶向药的临床研究进展，也发现HER2的检测中存在一些问题。/>[0004]目前采用免疫组织化学法（IHC）检测HER2蛋白表达水平，应用原位杂交（ISH）法检测HER2基因扩增。
[0005]1）免疫组织化学法：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。流程为：通过石蜡包埋等方式进行组织固定、蛋白水解等方法进行抗原修复、组织中内源性酶和抗体的封闭、特异性抗体结合检测目标、通过显微镜观察样本。免疫组织化学法检测的缺陷是：1、需要组织样本，且需要进行样本固定等操作处理，存在取样困难，样本处理复杂缺点。2、没有绝对特异的抗体，特异性比较低。3、操作流程比较复杂、不适用自动化。
[0006]2）原位杂交：是核酸杂交技术的一种方式。其使用标记的互补DNA，RNA或修饰的核酸链（即探针）定位组织的一部分或部分中的特定DNA或RNA序列。流程为：玻片准备和样本固定、样品处理是把核酸暴露、探针选择、原位杂交、显微镜检测。原位杂交检测的缺陷是：1、需要组织样本，且需要进行样本固定等操作处理，存在取样困难，样本处理复杂缺点。2、RNA单链检测容易受RNA酶污染。3、特异性较低。4、杂交程度不能达到100%，特别是在应用较短的cDNA探针时，检测效率明显下降。5、操作流程比较复杂、不适用自动化。
[0007]3）有研究报道过类似的双抗夹心法检测外泌体HER2蛋白的方法（所使用的抗体：anti
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HER
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2 antibody，R＆D systems，cat no. AF1129），该方法采用的外泌体捕获方法为生物素
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亲和素结合，存在无法实现自动化的缺点；信号检测采用差分脉冲伏安法，存在灵敏度低的缺点。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是，提供一种外泌体表面HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒。主要解决现有技术中外泌体HER2蛋白检测程序复杂、特异性低的缺点。
[0009]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种外泌体表面HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括：磁珠悬液、HER2抗体反应液、洗涤液、发光激发液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体抗体；所述HER2抗体反应液包括HER2抗体、二抗抗体、化学发光标记物，其中化学发光标记物与二抗抗体偶联，HER2抗体上的多个抗原表位与二抗抗体进行特异性结合。
[0010]作为优选实施方案，所述磁珠微球包被的外泌体抗体为CD9、CD63和CD81中的一种或多种，所述外泌体抗体在磁珠悬液中的浓度为0.01～1ug/mL。
[0011]作为优选实施方案，所述磁珠悬液包括：0.1～30mg/mL的磁珠微球；1
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100mM的Tris；0.1
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1.0M的NaCl；0.1
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1.0M蔗糖；质量体积比0.1%
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4%的BSA，pH7.5
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8.5，溶剂为水。所述磁珠微球粒径优选为1～3 μm。
[0012]作为优选实施方案，所述HER2抗体反应液包括：0.01～0.1ug/mL的HER2抗体，质量体积比为0.01%
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1.0%的BSA，PBS缓冲液，pH7.0
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8.0。所述PBS缓冲液优选为1xPBS缓冲液。
[0013]作为优选实施方案，所述HER2抗体为鼠抗人源的HER2抗体，所述鼠抗人源的HER2抗体的浓度为0.05ug/mL。
[0014]作为优选实施方案，所述HER2抗体反应液中的二抗抗体为兔抗鼠或羊抗鼠的二抗抗体，浓度为0.01～0.1ug/mL。
[0015]作为优选实施方案，所述兔抗鼠或羊抗鼠的二抗抗体的浓度为0.03ug/mL。
[0016]作为优选实施方案，所述HER2抗体反应液中的化学发光标记物为吖啶酯。
[0017]作为优选实施方案，所述发光激发液包括激发液A和激发液B，所述激发液A包括体积百分比0.01～1%的H2O2和0.1～10 M的HNO3，溶剂为水；所述激发液B包括0.1～5 M的NaOH和体积浓度为0.01～1%的TWEEN
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20，溶剂为水。
[0018]作为优选实施方案，所述洗涤液包括1～20mM的Na2HPO4、0.5～10mM的NaH2PO4、0.1～2M的NaCl和体积浓度为0.01～1%的TWEEN
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20，溶剂为水。
[0019]本专利技术中涉及的英文缩写注释如下：RNA：核糖核酸DNA：脱氧核糖核酸cDNA：互补DNAHER2：人类表皮生长因子受体2ISH：原位杂交IHC：免疫组织化学法AE：吖啶酯BSA：牛血清白蛋白与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：1）本专利技术的外泌体表面HER2蛋白检测试剂盒，实现通过血浆、血清样本进行HER2蛋白表达量的检测。通过外泌体进行HER2蛋白表达检测，灵敏度高、特异性高。
[0020]2）本专利技术抗体反应液中的一个HER2抗体可以结合多个二抗抗体，形成磁珠CD系列
抗体
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外泌体HER2一抗
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N个二抗AE的结构，多个AE分子能够增强发光强度，显著提高检测灵敏度。
[0021]3）本专利技术的检测试剂盒采用免疫磁珠体系，可以实现HER2蛋白表达量的自动化操作，实现多样本同时进行检测，这样既灵敏又高效，且节约本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体表面HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括：磁珠悬液、HER2抗体反应液、洗涤液、发光激发液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体抗体；所述HER2抗体反应液包括HER2抗体、二抗抗体、化学发光标记物，其中化学发光标记物与二抗抗体偶联，HER2抗体上的多个抗原表位与二抗抗体进行特异性结合。2.如权利要求1所述的外泌体表面HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠微球包被的外泌体抗体为CD9、CD63和CD81中的一种或多种，所述外泌体抗体在磁珠悬液中的浓度为0.01～1ug/mL。3.如权利要求1所述的外泌体表面HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬液包括：0.1～30mg/mL的磁珠微球；1
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100mM的Tris；0.1
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1.0M的NaCl；0.1
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1.0M蔗糖；质量体积比0.1%
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4%的BSA，pH7.5
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8.5，溶剂为水。4.如权利要求1所述的外泌体表面HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述HER2抗体反应液包括：0.01～0.1ug/mL的HER2抗体，质量体积比为0.01%
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1.0%的BSA，PBS缓冲液，pH7.0
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8.0。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：马跃，蔡瑶，秦文星，赵小玉，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：