一种重叠环介导等温核酸扩增技术制造技术

本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种重叠环介导等温核酸扩增技术。具体技术方案包括：一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，所述扩增引物为重叠引物，所述重叠引物包括正向引物F和反向引物R，正向引物F的右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F互补的特定序列。本发明专利技术提供了一种新的LAMP引物设计及基因检测方法，首次提出了“重叠引物”的概念和设计思路，通过设计特异性的重叠引物，帮助多基因实现重叠环介导等温核酸扩增反应，引物设计方法简单、反应结果准确、反应效率高。反应效率高。反应效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种重叠环介导等温核酸扩增技术


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种重叠环介导等温核酸扩增技术。

技术介绍

[0002]环介导等温核酸扩增技术（loop
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mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新的恒温核酸扩增方法，具体为针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶等温(65℃左右)保温一段时间，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高的特点。
[0003]但由于LAMP扩增用的引物比较多，因此很难在同一个反应体系中进行双基因乃至多基因检测。目前虽然存在可以在同一反应体系中进行多基因检测的探针法，但该方法使用引物较多，体系相对繁琐复杂，引物设计难度高，反应干扰比较大，应用前景不理想。
[0004]因此，如果能提供一种引物设计简单、反应结果清晰的LAMP多基因检测方法，将具有重要的学术价值和商业价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种重叠环介导等温核酸扩增技术。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，所述扩增引物包括：（1）上游基因LAMP的正向引物F，（2）下游基因LAMP的反向引物R，（3）上游基因和下游基因的重叠引物，（4）中间基因与上游基因反应的反向LAMP引物，（5）中间基因与下游基因反应的正向LAMP引物，（6）相邻两条基因接头处的重叠引物。
[0007]优选的，各所述重叠引物分别包括正向引物F和反向引物R，正向引物F右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F互补的特定序列。
[0008]相应的，所述扩增引物在2个及以上基因检测中的应用。
[0009]优选的，所述应用方法包括：以FIP、BIP为内引物，所述重叠引物为叠加引物，以F3、B3为外引物对基因进行扩增。
[0010]优选的，所述方法的反应体系包括：1mM dNTPs、2.5μL 10
×
Bst Buffer、8U Bst DNA聚合酶、2μL待检测基因、外引物各0.2μM、内引物各1.2μM、重叠引物各0.2μM,ddH2O补齐至25μL。
[0011]优选的，反应条件为：65℃、60min。
[0012]优选的，所述反应发生在液体中或固体表面。
[0013]优选的，扩增对象为DNA和/或RNA。
[0014]优选的，所述应用为在检测病原体病毒、病原体细菌、病原体真菌、衣原体中的应用。
[0015]相应的，利用所述扩增引物制备的检测用试剂、试纸、试剂盒。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种新的LAMP引物设计及基因检测方法，首次提出了“重叠引物”的概念和设计思路，通过设计特异性的重叠引物，帮助多基因实现重叠环介导等温核酸扩增反应，引物设计方法简单、反应结果准确、反应效率高。
[0017]本专利技术提供的方法可以用于检测冠状病毒、HIV、乙肝、丙肝、流感、脑膜炎等病毒性疾病的病原体病毒、细菌性疾病的病原体细菌、病原体真菌、治病衣原体等，从而可用于肿瘤的诊断、肿瘤的分型恶性程度的鉴定；以及其它人体/动物/植物疾病的诊断和食品卫生的监测。
附图说明
[0018]图1为MS2引物设计示意图；图2为实施例一核酸电泳反应结果示意图；图3为SGIV引物设计示意图；图4为MS2
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SGIV重叠引物设计示意图；图5为CCHFV引物设计示意图；图6为实施例二核酸电泳反应结果示意图；图7为HCV引物设计示意图；图8为CCHFV
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HCV重叠引物设计示意图；图9为多基因设计原理示意图；图10为实施例三核酸电泳反应结果示意图。
具体实施方式
[0019]本专利技术提供了一种重叠环介导等温核酸扩增检测方法，具体包括如下步骤：1、设计重叠环介导等温核酸扩增引物。设计原理如图9所示。具体的，多基因检测的扩增引物包括：上游基因LAMP的正向引物F、下游基因LAMP的反向引物R，及上游基因和下游基因的两条重叠引物，中间基因需要设计与上游基因反应的反向LAMP引物，以及和下游基因反应的正向LAMP引物，相邻两条基因接头处设计重叠引物。
[0020]各所述重叠引物包括正向引物F和反向引物R，正向引物F右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R具有互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F具有互补的特定序列，重叠引物任意一条或者多条同时含有上下游DNA的序列不少于15bp。各引物可以使用引物设计程序例如PrimerExplorer进行设计。
[0021]通过设计特异性的重叠引物，使多基因能够进行重叠环介导等温核酸扩增的反应。
[0022]2、设计重叠环介导等温核酸扩增的扩增体系及方法。具体方法为：以FIP（Forward Inner Primer,上游内部引物）、BIP（Backward Inner Primer,下游内部引物）为内引物，重叠引物为叠加引物，以F3（Forward Outer Primer，上游外部引物）、B3（Backward Outer Primer，下游外部引物）为外引物对双基因进行恒温扩增。其反应体系为：1mM dNTPs（三磷酸脱氧核糖核苷酸），2.5μL 10
×
Bst Buffer，8U Bst DNA聚合酶，2μL待检测基因，外引物
各0.2μM，内引物各1.2μM，重叠引物各0.2μM,ddH2O补齐至25μL。将上述所有试剂混匀置于PCR管中，65℃、60min。
[0023]通过反应体系的设计使重叠环介导等温核酸扩增能将目的DNA或者RNA分子大量复制或先经过逆转录后大量复制，产生的扩增产物具有多重重复序列的DNA。
[0024]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0025]实施例一：设计重叠引物并扩增MS2
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SGIV特异性基因效果展示1、设计引物检测MS2特异性基因。MS2基因序列如SEQ ID NO.1所示，设计MS2引物如图1所示，引物序列具体如表1所示，反应体系如表2所示。
[0026]表1 环介导等温核酸扩增MS2引物序列表2 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图1（1～本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，其特征在于：所述扩增引物包括：（1）上游基因LAMP的正向引物F，（2）下游基因LAMP的反向引物R，（3）上游基因和下游基因的重叠引物，（4）中间基因与上游基因反应的反向LAMP引物，（5）中间基因与下游基因反应的正向LAMP引物，（6）相邻两条基因接头处的重叠引物。2.根据权利要求1所述扩增引物，其特征在于：各所述重叠引物分别包括正向引物F和反向引物R，正向引物F右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F互补的特定序列。3.权利要求1或2所述扩增引物在2个及以上基因检测中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：所述应用方法包括：以FIP、BIP为内...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡学军，
申请(专利权)人：上海先赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：