一种己糖激酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种己糖激酶表达及纯化方法，包括己糖激酶基因的克隆与分子构建、重组表达菌株的构建、重组己糖激酶的诱导表达、纯化与活力检测方法和己糖激酶高密度发酵放大等步骤。本发明专利技术第一次从酿酒酵母中克隆己糖激酶基因重组在大肠杆菌中表达，大大的提高了蛋白表达量和降低了蛋白纯化的难度，极大地简化了己糖激酶生产工艺；在实现己糖激酶的高效稳定表达的同时，通过优化诱导温度、诱导剂浓度、和诱导添加Mg

【技术实现步骤摘要】
一种己糖激酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种己糖激酶的表达和纯化的方法。

技术介绍

[0002]己糖激酶(Hexokinase，HK)是以己糖为特异性底物的六碳糖磷酸化酶，在生物体的糖酵解过程中起重要作用，其Km值小，对底物亲和性强，专一性不强，可针对多种六碳糖进行作用，可以催化葡萄糖从稳定状态变为活跃状态，为肿瘤细胞提供能量以及物质合成所必须的重要碳源，从而促进恶性肿瘤的生长和增值，利用其作用原理和特点，该酶主要用于临床诊断试剂，特别是血液中葡萄糖的临床检测。
[0003]目前可工业化的己糖激酶大都来源于原始菌发酵，或者动植物细胞培养，产量有限；纯化相对困难，后处理工艺成本较高；国内一些产品性质不够稳定，国外竞品性质相对较稳定，但价格昂贵。故己糖激酶试剂端应用受限明显，为此我们从酿酒酵母中克隆了己糖激酶基因在大肠中进行重组表达，以期获得性质优良的纯品酶粉，代替进口产品，并且期待用大肠杆菌表达体系提高己糖激酶的产量。

技术实现思路

[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了一种己糖激酶的制备方法，具体步骤如下：
[0005]S1、己糖激酶基因的克隆
[0006]从酿酒酵母菌中提取总DNA，根据编码己糖激酶蛋白的基因HXK1序列设计F引物和R引物，进行PCR扩增反应；
[0007]PCR反应体系：5μL LA
‑
Taq缓冲液，5μL 2.5mM dNTP，1μL基因组DNA，1μL10mM F引物，1μL10mM R引物，0.5μL 2.5UμL
‑
1LA
‑
Taq聚合酶，加水至50μL；
[0008]扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min；
[0009]S2、重组表达菌株的构建
[0010]通过S1得到带有酶切位点和载体同源序列的HXK1基因，通过双酶切和T4连接酶反应，将HXK1基因片段插入到表达质粒中，得到HXK1的表达载体；
[0011]将构建的HXK1的表达载体转化到表达宿主细胞中，得到重组HXK1的表达菌株；
[0012]S3、重组HXK1表达菌株的诱导表达
[0013]在严格的无菌条件下，将S2得到的重组HXK1表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，加入IPTG，诱导表达后收集菌体；
[0014]S4、纯化与活力检测方法
[0015]将S3收集的菌体用15mL pH 8.0 20mM的Tris
‑
HCl缓冲液重悬，冰浴，超声破碎，10000rpm下离心细胞破碎液10min，收集上清液，过0.22um滤膜，采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，得到纯化HXK1蛋白；
[0016]S5、己糖激酶高密度发酵放大
[0017]将S2获得的种子液以1％～2％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养；
[0018]高密度发酵产出的己糖激酶菌体按照质量体积比1:10的浓度，用20mM pH 8.0Tris
‑
HCl进行重悬，均质机破碎，絮凝剂絮凝后离心过膜备用；
[0019]镍离子亲和层析柱对进行纯化，洗脱后的酶液通过Millipore超滤系统置换和浓缩。
[0020]优选的，S1中HXK1基因的N端添加纯化标签，所述纯化标签选自His
‑
tag、MBP、GST、Sumo。
[0021]优选的，表达质粒载体选自pET系列表达载体。
[0022]进一步，优选的，表达质粒载体选自pET28a、pET15b、pET21a、pET30a、pGEX。
[0023]其中，所述S3具体步骤包括：
[0024]S3.1、在严格的无菌条件下，将重组表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养12h；
[0025]S3.2、按照体积比0.5％接种量取1mL种子液接种到含200mL卡那霉素的500mL LB液体培养基中，37℃培养3h左右，保证OD至0.8～1.0左右，温度降至25℃加入终浓度0.5mM的IPTG，保持25℃，诱导表达16h后收集菌体。
[0026]优选的，所述S4中超声破碎条件为200W，超声3S，停2S，共计15min。
[0027]所述S4中镍离子亲和层析具体步骤包括：取2mL填料的镍柱先用超纯水冲洗保存在柱料中的20％乙醇20个柱体积，用20mM pH 8.0的Tris
‑
HCl 5个柱体积后开始上样，收集流穿酶液，依次在平衡液中添加20mM、400mM、500mM咪唑终浓度进行洗杂、洗脱和洗柱操作，各5个柱体积，收集不同梯度的样品，进行活力分析和SDS
‑
page纯度分析。
[0028]所述S5中发酵罐中进行通气搅拌培养培养条件为：转速100～120rpm，通气量0.5～1.0vvm，温度37℃，罐压0.03～0.06MPa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至400rpm，通气量至2.0vvm，控制pH 7.0～7.1，根据pH调整补料，发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，降温并继续培养10～16h诱导结束下罐，最终下罐OD在80左右。
[0029]优选的，所述S5通过控制补料培养基中葡萄糖的加入速度控制培养基的碳氮比，通过补碱泵控制发酵罐内的pH以及诱导过程通过加入Mg
2+
以提高己糖激酶的产量和比活力。
[0030]所述Mg
2+
优选的来源为MgCl2，MgSO4，MgCO3。
[0031]本专利技术的技术优点在于：
[0032]1、克隆了来源酿酒酵母的己糖激酶基因，重组在大肠杆菌中表达，大大提高了己糖激酶的产量；
[0033]2、解决了从原始菌株中提取或者细胞组织中大批量提取的难度，重组表达在基因的N端添加了6个His
‑
tag纯化标签，为工艺化生产极大地简化了纯化步骤。
[0034]3、在大肠重组表达获得己糖激酶解决目前部分己糖激酶比活低和稳定性差的问题。
附图说明
[0035]图1：本专利技术己糖激酶表达及纯化过程样品电泳图；
[0036]图2：本专利技术发酵工艺前发酵OD和单位比活力示意图；
[0037]图3：本专利技术工艺优化后发酵OD和单位比活力示意图；
[0038]图4：本专利技术发酵工艺优化前后己糖激酶蛋白性质对比示意图。
具体实施方式
[0039]以下是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本专利技术的保护范围。
[0040]本专利技术实施例中使用的限制性内切酶购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种己糖激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、己糖激酶基因的克隆从酿酒酵母菌中提取总DNA，根据编码己糖激酶蛋白的基因HXK1序列设计F引物和R引物，进行PCR扩增反应；PCR反应体系：5μL LA
‑
Taq缓冲液，5μL 2.5mM dNTP，1μL基因组DNA，1μL10mM F引物，1μL10mM R引物，0.5μL 2.5UμL
‑
1LA
‑
Taq聚合酶，加水至50μL；扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min；S2、重组表达菌株的构建通过S1得到带有酶切位点和载体同源序列的HXK1基因，通过双酶切和T4连接酶反应，将HXK1基因片段插入到表达质粒中，得到HXK1的表达载体；将构建的HXK1的表达载体转化到表达宿主细胞中，得到重组HXK1的表达菌株；S3、重组HXK1表达菌株的诱导表达在严格的无菌条件下，将S2得到的重组HXK1表达菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，加入IPTG，诱导表达后收集菌体；S4、纯化与活力检测方法将S3收集的菌体用15mL pH 8.0 20mM的Tris
‑
HCl缓冲液重悬，冰浴，超声破碎，10000rpm下离心细胞破碎液10min，收集上清液，过0.22um滤膜，采用镍离子亲和层析柱对进行纯化，得到纯化HXK1蛋白；S5、己糖激酶高密度发酵放大将S2获得的种子液以1％～2％的比例接种于灭过菌的发酵罐中进行通气搅拌培养；高密度发酵产出的己糖激酶菌体按照质量体积比1:10的浓度，用20mM pH 8.0Tris
‑
HCl进行重悬，均质机破碎，絮凝剂絮凝后离心过膜备用；镍离子亲和层析柱对进行纯化，洗脱后的酶液通过Millipore超滤系统置换和浓缩。2.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S1中HXK1基因的N端添加有纯化标签，所述纯化标签选自His
‑
tag、MBP、GST、Sumo，优选6个His标签。3.根据权利要求1所述的己糖激酶的制备方法，其特征在于，所述S2中表达质粒载体选自pET系列表达载体。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗漫杰，宫安，王梁，施婧妮，徐灿，彭晶，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：