烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应用,烟粉虱致死基因为天门冬氨基氨酸转移酶的编码基因。烟粉虱致死基因与天门冬氨基氨酸转移酶的基因表达量和活性相关，能够催化转氨基反应，将氨基从天门冬氨酸转移到α

【技术实现步骤摘要】
烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应。

技术介绍

[0002]近年来，番茄褪绿病毒的危害并没有明显减少，而烟粉虱的防治依旧困难。物理防控主要有加强田间管理、及时清理田间杂草和带毒苗、设置防虫网以防止烟粉虱侵入、悬挂粘虫板以诱杀烟粉虱等。化学防控主要是喷洒5％噻嗪酮（扑虱灵）可湿性粉剂、10％吡虫啉可湿性粉剂、25％噻虫嗪水（阿克泰）分散剂等杀虫剂。尽管已有烟粉虱防治措施有很多，但是RNAi（RNA interference）技术在防治中应用仍然稀缺，尤其是关于烟粉虱的靶标太少，所以寻找既能控制烟粉虱同时又能控制病毒病的靶标迫在眉睫。
[0003]RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中由双链RNA（double
‑
stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi主要通过在转录后水平阻断基因表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。这是一种针对烟粉虱的特异性杀虫剂，对其他的昆虫、哺乳动物等没有危害，特异性高，见效快，致死率高，对环境无污染，属于一种新型绿色的杀虫方法。这为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种烟粉虱致死基因和RNA干扰剂以及RNA干扰剂的制备方法和应用。本专利技术的烟粉虱致死基因与天门冬氨基氨酸转移酶的基因表达量和活性相关，在携带ToCV病毒的烟粉虱中，其天门冬氨基氨酸转移酶的相对表达量和酶活均高于健康烟粉虱。根据烟粉虱天门冬氨基氨酸转移酶基因设计的RNA干扰剂可抑制天门冬氨基氨酸转移酶的相对基因表达量，从而降低烟粉虱代谢所吸收的氨基酸的能力，影响烟粉虱对氨基酸的消化和吸收，从而影响烟粉虱的生长发育，甚至可能导致烟粉虱死亡，从而有效控制烟粉虱种群增长，进而减少对病毒病的传播。而利用RNAi的技术减少病虫害的传播，具有绿色环保，抗虫性稳定，降低抗药性等优势。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种烟粉虱致死基因，所述烟粉虱致死基因为天门冬氨基氨酸转移酶的编码基因，所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的烟粉虱致死基因在杀灭烟粉虱中的应用。
[0007]基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种RNA干扰剂，所述RNA干扰剂根据上述的烟粉虱致死基因合成的dsRNA，所述dsRNA的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的RNA干扰剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：S1、根据天门冬氨基氨酸转移酶的编码基因序列合成引物对，提取烟粉虱RNA，以
提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链，S2、以烟粉虱的cDNA第一条链为模板，进行RT
‑
PCR得到扩增产物；S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到目标DNA片段；S4、将所述目标DNA片段用PROMEGA dsRNA合成试剂盒合成dsRNA，即为RNA干扰剂。
[0009]上述的制备方法，进一步的，所述S1中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]基于一种总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的RNA干扰剂在降低烟粉虱基因表达中的应用。
[0011]上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：（1）将15 %的蔗糖溶液与不同体积的AST dsRNA混匀得到饲喂营养液；（2）将饲喂营养液置于饲喂管中，与烟粉虱一起培养48 h；（3）计算饲喂RNA干扰剂后烟粉虱的死亡率，同时采用RT
‑
qPCR的方法检测饲喂后的烟粉虱体内AST的相对分子表达量。
[0012]上述的应用，进一步的，所述（2）中所述培养的条件为：光照比为14︰10，湿度80%。
[0013]上述的应用，进一步的，所述（3）中所述RT
‑
qPCR采用的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
[0014]基于一种总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的RNA干扰剂在降低烟粉虱获毒和传毒中的应用。
[0015]上述的应用，进一步的，所述应用方法包括以下步骤：（1）将饲喂了含AST dsRNA营养液的烟粉虱置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株中培养48 h，考察烟粉虱获取病毒率和获取病毒数量；（2）取食带毒苗48 h后，将烟粉虱通过虫传的方法进行传毒，观察饲喂RNA干扰剂后30 d内烟粉虱传播到番茄的病毒率和病毒数量。
[0016]现有技术相比，本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供了一种烟粉虱氨基酸代谢基因，烟粉虱致死基因为Aspartate aminotransferase（AST），Aspartate aminotransferase基因编码天门冬氨酸氨基转移酶，天门冬氨酸氨基转移酶，也称谷草转氨酶，是一种磷酸吡哆醛蛋白质，能够催化转氨基反应，将氨基从天门冬氨酸转移到α
‑
酮戊二酸。烟粉虱代谢基因与天门冬氨基氨酸转移酶的基因表达量和活性相关，在携带ToCV病毒的烟粉虱中，其天门冬氨基氨酸转移酶的相对表达量和酶活均高于健康烟粉虱。同时当降低烟粉虱体内天门冬氨基氨酸转移酶基因表达量时，也降低了烟粉虱对番茄褪绿病毒的获毒率和传播率，从而降低病毒病的发生。因此，基于天门冬氨基氨酸转移酶的特性，本专利技术可以设计阻断该基因表达的物质，从而达到杀灭烟粉虱的目的。
[0017]（2）本专利技术提供了一种RNA干扰剂，该RNA干扰剂是基于烟粉虱的天门冬氨酸氨基转移酶特异基因进行设计，合成AST dsRNA，该dsRNA可以诱发同源mRNA高效特异性降解，通过在转录后水平阻断天门冬氨酸氨基转移酶基因表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。从而能降低烟粉虱代谢所吸收的氨基酸的能力，影响烟粉虱对氨基酸的消化和吸收，从而影响烟粉虱的生长发育，甚至可能导致烟粉虱死亡。从而有效控制烟粉虱种群增长，进
而减少对番茄褪绿病毒病的传播。而利用RNAi的技术减少病虫害的传播，具有绿色环保，抗虫性稳定，降低抗药性等优势。
[0018]（3）本专利技术提供了一种RNA干扰剂，该RNA干扰剂是基于Aspartate aminotransferase设计的dsRNA，这是一种针对烟粉虱的特异性杀虫剂，对其他的昆虫、哺乳动物等没有危害，特异性高，见效快，致死率高，对环境无污染，属于一种新型绿色的杀虫方法。这为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。
附图说明
[0019]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟粉虱致死基因，其特征在于，所述烟粉虱致死基因为天门冬氨基氨酸转移酶的编码基因，所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种权利要求1所述烟粉虱致死基因在杀灭烟粉虱中的应用。3.一种RNA干扰剂，其特征在于，所述RNA干扰剂根据权利要求1所述的烟粉虱致死基因合成的dsRNA，所述dsRNA的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种权利要求3所述的RNA干扰剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：S1、根据天门冬氨基氨酸转移酶的编码基因序列合成引物对，提取烟粉虱RNA，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链，S2、以烟粉虱的cDNA第一条链为模板，进行RT
‑
PCR得到扩增产物；S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到目标DNA片段；S4、将所述目标DNA片段用PROMEGA dsRNA合成试剂盒合成dsRNA，即为RNA干扰剂。5.根据权利要求4所述的RNA干扰剂的制备方法，其特征在于，所述S1中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。6.一种权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：史晓斌，卢丁伊慧，刘勇，张德咏，张战泓，张卓，谭新球，郑立敏，高阳，彭静，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：