高活性的mTET2酶突变体、其编码DNA及其应用制造技术

本发明专利技术提供了高活性的mTET2酶突变体，mTET2CDT和mTET2CDTm。mTET2CDT是在野生型mTET2氨基酸序列(Uniprot：Q4JK59

【技术实现步骤摘要】
高活性的mTET2酶突变体、其编码DNA及其应用


[0001]本专利技术专利涉及高活性的mTET2酶突变体mTET2CDT和mTET2CDTm、其编码DNA及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常见的碱基修饰方式，约占所有胞嘧啶的1%
‑
8%，被称为“第五种碱基”。DNA甲基化与染色质状态和基因转录活跃程度具有明显的相关性，是预测基因表达水平的有效依据。因此，DNA甲基化水平检测是临床疾病诊断的有效手段。现有的DNA甲基化检测技术主要是依赖于反向筛选的重亚硫酸盐转化法，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，再通过PCR扩增转变成胸腺嘧啶。这种方法具有DNA损伤大、背景噪音高和准确性低等缺陷。近年来，酶转化法甲基化检测技术因为具备DNA损伤小、背景噪音低、准确性高和数据质量好等优点而成为DNA甲基化检测领域的重要关注点。
[0003]DNA羟甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一种α
‑
酮戊二酸（α
‑
KG）和Fe2+依赖的双加氧酶，在生物进化过程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化过程的关键蛋白，可以将5mC通过三步氧化反应（5mC
‑
5hmC
‑
5fC
‑
5caC）转变成5caC。目前的酶转化法DNA胞嘧啶甲基化检测技术都是依赖于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶转化法DNA甲基化检测技术的核心蛋白，具有极大的工程改造和应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了两种高活性的mTET2酶突变体mTET2CDT和mTET2CDTm。mTET2CDT是在野生型mTET2氨基酸序列(Uniprot：Q4JK59
‑
1)中，只保留1042
‑
1347和1747
‑
1848两个结构域的氨基酸序列，中间用GGGGS来进行连接得到的融合蛋白，其序列如SEQ ID No.3所示，编码DNA序列如SEQ ID No.1所示。mTET2CDTm在mTET2CDT的基础上进行了V1307L和V1309C点突变，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，编码DNA序列如SEQ ID No.2所示。mTET2CDT和mTET2CDTm显著提高了mTET2的氧化活性。此外，mTET2CDTm还提高了氧化5mC过程中5hmC中间产物的占比。这两个高活性的TET酶突变体有效地DNA甲基化检测灵敏度和准确性，可以应用于疾病诊断，尤其是在肿瘤早筛领域。
[0005]优选的，我们公布了mTET2CDT和mTET2CDTm在DNA甲基化检测中的应用，其步骤包括：（1）在待测样本中加入所述的TET酶突变体进行氧化反应，将样本中的5mC氧化成5hmC；（2）终止反应，回收DNA；（3）DNA甲基化检测分析。
[0006]优选的，所述应用步骤（1）中还加入TET酶氧化缓冲液。
[0007]更为优选的，所述TET酶氧化缓冲液配比为：
组分用量待测DNA1
‑
100ng10
×
mTETbuffer3μL3mM硫酸亚铁铵1
‑
10μL10μMmTET2酶突变体1
‑
8μL补ddH2O至30μL其中10
×ꢀ
mTET buffer的配比为：组分用量HEPES
‑
KOH（pH7.0
‑
8.0）50
‑
100mMNaCl50
‑
150mMα
‑
酮戊二酸1
‑
5mML
‑
抗坏血酸2
‑
10mMATP1
‑
5mMDTT2
‑
5 mM优选的，所述应用步骤（1）中氧化反应的过程为：37℃保温10
‑
60 min。
[0008]优选的，步骤（2）中使用0.1
‑
1 mg/ml的蛋白酶K、0.1
‑
1%的十二烷基硫酸钠或者1
‑
50 mM的乙二胺四乙酸来终止反应。
[0009]优选的，所述应用步骤（2）中终止反应的过程为：45
‑
65℃保温3
‑
30 min。
[0010]本专利技术提供了两种高活性的mTET2突变体mTET2CDT和 mTET2CDTm，显著提高了mTET2的氧化活性。此外，mTET2CDTm还提高了氧化5mC过程中5hmC中间产物的占比。与野生型TET2相比，这两个高活性的TET酶突变体明显提高了DNA甲基化检测灵敏度和准确性，可以应用于疾病诊断，尤其是在肿瘤早筛领域。
附图说明
[0011]图1 mTET2重组蛋白及突变体氧化5mC效率示意图。
[0012]图2 mTET2重组蛋白及突变体酶比活力的比较。
[0013]图3 mTET2重组蛋白及突变体氧化5mC后氧化产物的占比。
[0014]图4 MAPS
‑
qPCR验证mTET2重组蛋白及突变体对DNA甲基化的检测效果。
[0015]图5 MAPS
‑
seq验证mTET2重组蛋白及突变体对制备DNA片段中甲基化位点的检测效果。
[0016]图6 MAPS
‑
seq验证mTET2重组蛋白及突变体对5mC DNA标准品中甲基化位点的检测效果。
具体实施方式
[0017]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做进一步说明。SEQ ID No.1是 mTET2CDT的编码DNA序列，SEQ ID No.2是mTET2CDTm的编码DNA序列， SEQ ID No.3是mTET2CDT的氨基酸序列，SEQ ID No.4是mTET2CDTm的氨基酸序列。
[0018]图1为mTET2、mTET2CDT、MBP
‑
mTET2CDT氧化5mC效率示意图。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。本实施例所使用的探
针和引物序列及修饰如表1所示。
[0019]表1 探针及引物序列实施例1：mTET2、mTET2CDT、mTET2CDTm酶比活性的测试。
[0020]使用Epigentek的Epigenase 5mC
‑
羟化酶TET活性/抑制分析试剂盒（荧光法）按照说明书的流程来测定mTET2、mTET2CDT、mTET2CDTm将5mC转化成5hmC的酶比活性。
[0021]结果见图2，mTET2CDTm具有最高的酶比活性，5hmC产物占比最高, mTET2CDT次之，mTET2最低。
[0022]实施例2：mTET2、mTET2CDT、mTET2CDTm对5mC oligo的氧化能力的测定。
[0023]在本实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性的mTET2酶突变体mTET2CDT，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。2.权利要求1所述的高活性的mTET2酶突变体mTET2CDT的编码DNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.一种高活性的mTET2酶突变体mTET2CDTm，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。4.权利要求3所述的高活性的mTET2酶突变体mTET2CDTm的编码DNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。5.权利要求1或3所述的高活性的TET酶mTET2CDT或mTET2CDTm在DNA甲基化检测中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于其步骤包括：（1）在待测样本中加入权利要求1或3中所述的TET酶突变体进行氧化反应，将样本中的5mC氧化成5hmC；（2）终止反应，回收DNA；（3）DNA甲基化检测分析。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤（1）中还加入TET酶氧化缓冲液。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述TET酶氧化缓冲液配比为：组分用量待测DNA1
‑
100ng10
×
mTETbuffer3μL3mM硫酸亚铁铵1
‑
10μL10μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯策，韦磊，江翱，陈晶晶，黄开喻，滕以刚，曹振，宋东亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：