检测基因组编辑制造技术

提供方法、组合物和试剂盒，用于定量细胞基因组或细胞群的基因组中双链断裂的数量或频率。频率。频率。

【技术实现步骤摘要】
检测基因组编辑
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2015年3月17日提交的美国临时申请62/134,517号的优先权，该文通过引用全文纳入本文用于所有目的。

技术介绍

[0003]双链断裂点可以通过各种不同的机制在细胞的基因组中出现。例如，化学诱变剂，高强度磁场或电离辐射可引入双链断裂点。作为另一个实例，可以通过各种基因组编辑试剂或方法将双链断裂点引入基因组。
[0004]理想的基因组编辑试剂只会在基因组中的一个或多个“定靶”位点产生双链断裂点。然而，目前的基因组编辑试剂常在基因组中的一个或多个“脱靶”位点产生双链断点。在某些情况下，这种脱靶位点与定靶位点高度同源。对于已知序列并且具有少量高度同源的脱靶部位的基因组，可以使用任何数量的可用方法鉴定和测定这种高度同源的脱靶位点。然而，脱靶编辑的位置，数量和频率通常是不可预测的。此外，由化学诱变剂，高强度磁场或电离辐射引入的双链断裂本质上是不可预测的。
[0005]通过全基因组下一代测序可以确定细胞整个基因组中双链断裂的定性和定量。然而，这可能是相当昂贵和耗时的，并且对于测定细胞群(例如，从生物体的样品获得的细胞群)或用于优化基因组编辑试剂和方法来说是不切实际的。

技术实现思路

[0006]在第一方面，本专利技术提供定量细胞基因组中双链断裂点数量的方法，所述方法包括：a)从所述细胞提供基因组核酸，其中所述基因组核酸在细胞中的双链断点插入有外源供体多核苷酸或其部分；b)将基因组核酸片段化以产生多个基因组核酸片段，其中至少一个基因组核酸片段含有所述插入的供体多核苷酸或其部分；c)产生包含环状基因组核酸片段和扩增引物对的多个混合物分区，其中所述扩增引物对与供体多核苷酸或其部分的相反链互补，并且其中所述扩增引物对定向为使得，当在环化前与含有所述插入的供体多核苷酸或其部分的基因组核酸片段杂交时，5'端彼此接近并且3'端彼此远离；d)用该扩增引物对扩增基因组核酸片段，以选择性地在包括含有所述插入的供体多核苷酸或其部分的一个或多个基因组片段的混合物分区中产生扩增子；e)检测扩增子；和f)计数含扩增子的混合物分区的数量，从而定量细胞基因组中的双链断裂点的数量。
[0007]在第二方面，本专利技术提供检测或定量细胞基因组中双链断裂点数量的方法，所述方法包括：提供基因组核酸片段，其中所述基因组核酸片段的至少一部分包含插入的外源供体寡核苷酸；对片段分区；在适于选择性地扩增包括含插入的片段的分区的条件下孵育分区；检测分区中的选择性扩增产物；和定量其中检测到选择性扩增产物的分区的数量。
[0008]在一些实施方式中，生成包含循环基因组核酸片段的多个混合物分区包括使该基因组核酸片段环化，并将环化的基因组核酸片段划分成多个混合物分区。在一些实施方式中，生成包含循环基因组核酸片段的多个混合物分区包括将所述基因组核酸片段划分成多
个混合物分区并使所述分区中的基因组片段环化。在一些实施方式中，所述方法还包括对细胞群进行a)
‑
f)，从而定量细胞群的基因组中的双链断裂点的数量。在一些实施方式中，所述双链断点中的至少一个由外源基因组编辑试剂诱导。在一些实施方式中，所述双链断裂点中的至少一个由化学诱变剂或电离辐射诱导。
[0009]在一些实施方式中，供体多核苷酸是双链供体多核苷酸。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸包含5'或3'硫代磷酸酯连接。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸包含5'和3'硫代磷酸酯连接。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸包含钝的5'和3'端。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸是5
’
磷酸化的。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸的长度为20
‑
150bp。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸的长度为25
‑
50bp。在一些情况中，所述双链供体多核苷酸的长度为30
‑
40bp。在一些情况中，双链供体多核苷酸的长度为34bp。
[0010]在一些实施方式中，供体多核苷酸是单链。在一些实施方式中，所述扩增引物对的5'端与所述供体多核苷酸的相反链上的重叠区域杂交。在一些实施方式中，所述重叠区域长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方式中，所述方法包括将包含所述插入的供体多核苷酸或其部分的环状基因组核酸片段线性化，并扩增该线性化的环状基因组核酸片段。在一些情况中，所述线性化包括切割所述插入的供体多核苷酸或其部分。
[0011]在一些实施方式中，所述片段化包括所述基因组DNA的随机剪切。在一些实施方式中，其中所述片段化包括使基因组DNA与核酸酶接触。在一些情况中，使基因组DNA与核酸酶接触在适于产生约256bp的平均片段长度的条件下进行。在一些情况中，核酸酶剪切(例如识别并剪切)四碱基对识别位点。在一些情况中，环化包括连接。
[0012]在一些实施方式中，检测扩增子包括在双链DNA扩增子的存在下检测插入染料的荧光增加。在一些情况中，定量所述混合物分区中所述插入染料的荧光增加，从而检测所述混合物分区中的扩增子的大小。在一些实施方式中，所述方法还包括通过在特异性检测所述内源基因组序列的内源参照探针存在下扩增所述内源核酸序列来检测所述基因组的内源性核酸序列。
[0013]在一些实施方式中，所述方法还包括检测与所述生物体的基因组异源并通过连接两个内源性非连续基因组核酸片段产生的异源序列，其中检测所述异源序列包括在存在特异性检测该异源序列的异源参照探针的情况下扩增该异源序列。在一些实施方式中，所述方法还包括检测与所述生物体的基因组异源并通过环化(例如连接)基因组核酸片段产生的异源序列，其中检测所述异源序列包括在存在特异性检测该异源序列的异源参照探针的情况下扩增该异源序列。在一些情况中，参照探针是水性探针或分子信标。
[0014]在一些情况中，参照探针检测靠近定靶基因组编辑试剂切割位点的序列。在一些情况中，所述方法包括计数含有扩增子和靠近定靶基因组编辑试剂切割位点的序列的混合物分区的数量，由此检测多个定靶基因组插入。在一些情况中，所述方法包括比较i)和ii)的比例，其中：i)是包含扩增子和靠近定靶基因组编辑试剂切割位点的序列的混合物分区的数量；和ii)是含有扩增子的混合物分区的数量，从而通过基因组编辑试剂或方法确定定靶基因组编辑的比率。
[0015]在一些实施方式中，所述方法包括计数含有扩增子并且不含靠近定靶基因组编辑试剂切割位点的序列的混合物分区的数量，由此检测多个脱靶基因组插入。在一些情况中，所述方法包括比较i)和ii)的比例，其中：i)是包含扩增子并且不含靠近定靶基因组编辑试
剂切割位点的序列的混合物分区的数量；和ii)是含有扩增子的混合物分区的数量，从而通过基因组编辑试剂或方法确定脱靶基因组插入的比率。
[0016]在一些实施方式中，所述多个混合物分区包括乳液液滴。在一些实施方式中，所述多个混合物分区包括微升、纳升、或皮升的孔或反应室。
[0017]附图简要说明
[0018]图1：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于定量细胞基因组中的双链断裂点数量的方法，所述方法包括：a)提供多个基因组核酸片段，其中至少一个基因组核酸片段含有插入的供体多核苷酸或其部分；b)产生包含环状基因组核酸片段和扩增引物对的多个混合物分区，所述环状基因组核酸片段是通过在产生分区之前或之后环化基因组核酸片段产生的，其中所述扩增引物对与供体多核苷酸或其部分的相反链互补，并且其中所述扩增引物对定向是，当在基因组核酸片段环化前扩增引物对与含有所述插入的供体多核苷酸或其部分的基因组核酸片段杂交时，扩增引物对的5'端彼此接近并且3'端彼此远离；c)用该扩增引物对扩增基因组核酸片段，以选择性地在包括含有所述插入的供体多核苷酸或其部分的一个或多个基因组片段的混合物分区中产生扩增子；d)检测混合物分区中的扩增子；和e)计数含扩增子的混合物分区的数量，从而定量细胞基因组中的双链断裂点的数量。2.如权利要求1所述的方法，其中，生成包含环状基因组核酸片段的多个混合物分区包括使该基因组核酸片段环化，并将环化的基因组核酸片段划分成多个混合物分区。3.如权利要求1所述的方法，其中，生成包含环状基因组核酸片段的多个混合物分区包括将所述基因组核酸片段划分成多个混合物分区并使所述分区中的基因组片段环化。4.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括对细胞群进行a)
‑
e)，从而定量细胞群的基因组中的双链断裂点的数量。5.如权利要求1所述的方法，其中所述双链断裂点中的至少一个由外源基因组编辑试剂诱导。6.如权利要求1所述的方法，其中所述双链断裂点中的至少一个由化学诱变剂或电离辐射诱导。7.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的提供包括产生双链断裂点和引入外源供体多核苷酸，所述供体多核苷酸是双链供体多核苷酸。8.如权利要求7所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸包含5'或3'硫代磷酸酯连接。9.如权利要求7所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸包含5'和3'硫代磷酸酯连接。10.如权利要求7所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸包含钝的5'和3'端。11.如权利要求7所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸是5'磷酸化的。12.如权利要求7
‑
11中任一项所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸的长度为20
‑
150bp。13.如权利要求12所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸的长度为25至50bp。14.如权利要求12所述的方法，其中所述双链供体多核苷酸的长度为34bp。15.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的提供包括产生双链断裂点和引入外源供体多核苷酸，所述供体多核苷酸是单链的。16.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增引物对的5'端与所述供体多核苷酸的相反链上的重叠区域杂交。17.如权利要求16所述的方法，其中所述重叠区域的长度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：