大豆脂氧酶以及7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代的筛选鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆脂氧酶以及7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代的筛选鉴定方法。本发明专利技术通过改变操作流程和试剂组分与配比，通过一次痕量取样实现了脂氧酶三个同工酶Lox

【技术实现步骤摘要】
大豆脂氧酶以及7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代的筛选鉴定方法


[0001]本专利技术涉及大豆种子的筛选鉴定方法，尤其涉及大豆脂氧酶以及7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代的筛选鉴定方法，属于大豆种子的筛选鉴定领域。

技术介绍

[0002]脂氧酶缺失性状受双隐性基因控制，11S球蛋白3个亚基缺失都属于纯隐性性状，7S缺失属于单一显性基因控制的。因此，在大豆育种过程中，脂氧酶、7S、11S球蛋白亚基缺失与否，在F2代就会出现性状分离，即理论上在F2代，可以筛选出含缺失性状的种子，这样可以在早期世代获得目标种子，其好处降低检测工作量及检测成本，防止在高世代筛选导致工作量及检测成本的几何级数的增加而无法进行。因此，如果能在种子量较少的F2代能够精准的鉴定出含有多个目标性状的极少数的种子，是既经济有效又简便可行的最佳筛选鉴定时期。
[0003]长期以来，大豆高产育种一直是广大的育种家致力解决的重要育种目标，相比之下，能够满足市场需求的以强调功能营养健康与高附加值为育种目标的大豆种子成分改良育种一直没有被广大育种家所重视，而原有的传统的以高产为育种目标的常规育种技术，基本上就是一把尺子一杆秤就可以了，它无法满足以功能营养健康为育种目标的种子成分改良育种，适于大豆种子成分改良育种应用的F2分离世代的种子检测鉴定技术，已经成为制约大豆种质资源创新与新品种培育的卡脖子问题。
[0004]目前分析大豆种子成分的方法多为食品级检测方法，其特点是该类方法取样量大，至少需要100mg左右，而一粒大豆种子重量也不过200mg，该重量仅够分析一种成分含量，即便确认该粒种子含有需要的目标性状，若要将该种子继续扩繁，种子会因伤害过重，种到地里而无法正常出苗。更不用说要对种子分析两种以上成分含量了，分析一种成分都要对该种子取一次样，取两次样就不够取了，无法完成种子的继代繁殖。因此，常规的大豆育种的成分鉴定，都是在F6代以后种子的性状稳定且数量足够时才进行关联成分的鉴定，其缺点在于种子到了F6代时，种子数量虽然足够鉴定了，但是含有目标成分的种子往往仅仅是其中的某几粒几十粒种子，从多达十几万粒的种子中，精准鉴定出某几粒种子，需要浪费大量的人、财、物及宝贵的农时，如同大海捞针，即便如此，也未必就能筛选到目标种子。
[0005]现有的用于检测检测7S和11S球蛋白亚基缺失或者脂氧酶缺失的主要方法包括：聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS
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PAGE鉴定法：在种子取样方式上：从远离种脐的位置切取8
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10mg粉末，提取蛋白，跑胶、染色、脱色、观察7S、11S球蛋白亚基缺失与脂氧酶三个同工酶蛋白条带是否缺失。其优点是：简单易操作，易掌握，可用于不受取样量限制的食品各类蛋白成分的检测鉴定，因其取样量过大，无法用于需单粒分析的F2杂交种后代的多成分复合性状缺失筛选鉴定。此外，该方法还存在以下缺陷：1.对于分子量接近的蛋白亚基的区分比较困难，脂氧酶缺失鉴定就存在这样的问题，由于脂氧酶由三个同工酶构成，其分子量在94
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97Kd之间，体现在SDS
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PAGE凝胶上，他们的条带很接近几乎落到一起，鉴定三个同工酶同时
缺失时比较容易，当需要鉴定其中一个酶缺失时比较困难，存在误判率高的缺点；2.检测周期长，一个周期下来，至少需要12个小时以上。3.取样量大，种子受损严重，在土壤发芽过程中易导致霉变，无法确保含目标基因种子安全出苗，繁殖后代。
[0006]β
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胡萝卜素褪色法：该方法是利用β
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胡萝卜素可以使Lox
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3褪色，亚甲蓝可使Lox
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1褪色的原理，根据lx与1x2强连锁，lx3与lx1x2符合独立分离规律，当种子三个同工酶存在时，会使亚甲蓝的蓝色和β
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胡萝卜素的黄色退掉，检出液变为无色。但都缺失时，检出液的颜色就是亚甲蓝的蓝色和β
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胡萝卜素黄色混合后便成为绿色，根据这个原理，来进行鉴定脂氧酶缺失与否。该方法主要存在以下缺陷：β
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胡萝卜素很不稳定，操作过程中遇空气极易被氧化，导致颜色判定失误；取样量大，都要8
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10mg才可以检测，对种子伤害过大，影响杂交后代出苗。
[0007]以上两种检测方法都存在取样量大，影响出苗问题，还存在无法精准鉴定，给育种过程造成不必要的工作量加大，既存在鉴定不准确有浪费大量的人财物，消耗大量的试剂，易造成环境污染。
[0008]聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体：Ampholine,从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，其顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。因为蛋白质为两性电解质，其所带的电荷的性质和数量随所处的环境的pH而变化，当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动，当蛋白质样品泳动到某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不在移动，则聚焦成一条蛋白质条带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置聚焦的方法为等电聚焦电泳法。其优点是鉴定准确，不易误判。但是存在以下几方面的缺陷：1.操作程序繁杂，不易掌握，适于样品量少的分析检测。。2.同样存在检测周期长，工作效率低的问题，不适于有农时限制的大量F2种子的检测。3.存在苗前取样检测，伤害种子，无法确保含目标基因种子安全出苗，繁殖后代的问题。
[0009]在培育大豆脂氧酶、7S、11S球蛋白亚基复合性状缺失基因聚合新品种的选育过程中，如何能对杂交后代F2分离世代每一粒种子的脂氧酶、7S、11S球蛋白亚基的缺失与否，通过一次痕量取样分析就可以进行精准鉴定，而且要能确保鉴定后的个体能够正常地完成世代增殖繁育，为培育脂氧酶、7S、11S球蛋白各亚基复合性状缺失大豆新品种提供技术支持。
[0010]因此，开发一种一次痕量取样，可同时监测鉴定多种大豆种子成分含量，又不影响期出苗繁殖后代的方法，已经成为食品加工专用高附加值功能性大豆改良育种的能否成功实现的瓶颈问题。

技术实现思路

[0011]本专利技术的主要目的是提供一种对大豆种子只需进行一次痕量取样就可对大豆脂氧酶与7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代进行筛选鉴定方法；
[0012]为实现上述目的，本专利技术所提供的主要技术方案包括：
[0013]一种大豆脂氧酶以及7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代的筛选鉴定方法，包括：
[0014](Ⅰ)将F2代大豆种子种脐相反侧小块种皮剥离掉并纵向切取小块样品装入到试管中；
[0015](Ⅱ)向试管中先加入Lox
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3检出液，轻摇，静置观察并记录反应液颜色；再加入Lox
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1检出液，轻摇，静置后观察并记录终反应液的颜色；当终反应颜色为绿色时，判定大豆种子样品为Lox
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1,2,3三个同工酶完全缺失；当终反应颜色为无色时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大豆种子脂氧酶以及7S、11S球蛋白亚基缺失杂交后代的筛选鉴定方法，其特征在于，包括：(Ⅰ)剥离掉F2代大豆种子种脐相反侧小块种皮，并纵向切取小片样品至试管中备用；(Ⅱ)向试管中先加入Lox
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3检出液，轻摇，静置观察并记录反应液颜色；再加入Lox
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1检出液，轻摇，静置后观察并记录终反应液的颜色；当终反应颜色为绿色时，判定大豆种子样品为Lox
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1,2,3三个同工酶完全缺失；当终反应颜色为无色时，判定大豆种子样品为Lox
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1,2,3三个同工酶均不缺失；当终反应颜色为黄色时，判定大豆种子样品为Lox
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3缺失；当终反应颜色为蓝色时，判定大豆种子样品为Lox
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1,2缺失；(Ⅲ)7S与11S球蛋白亚基缺失检测鉴定：(a)向步骤(Ⅱ)完成同工酶鉴别的试管中加入1M盐酸，将混有Lox
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3和Lox
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1检出液的pH值调整至酸性，静置，离心，去上清液，留下沉淀备用；(b)向获得沉淀中加入蛋白质提取液提取得到粗蛋白；(c)将得到粗蛋白进行ISDS
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PAGE改良聚丙烯酰胺凝胶电泳；对分离胶进行切角标记之后将分离胶从胶板上取下，依次进行染色、脱色处理后，在普通荧光灯箱上或通过凝胶成像系统观察辨识7S球蛋白3个亚基和11S球蛋白3个亚基的缺失与否。2.根据权利要求1所述的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤(Ⅰ)中用刀片剥离掉大豆种脐相反侧小块种皮，并纵向切取3
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4mg样品至2.0ml试管中备用。3.根据权利要求1所述的筛选鉴定方法，其特征在于，所述Lox
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1检出液的配制方法包括：依次加入0.2M硼酸钠缓冲液、10mM亚油酸钠溶液、去离子水和100μM亚甲蓝溶液，轻摇混匀，即得；所述Lox
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3检出液的配制方法包括：按顺序依次加入0.2M磷酸钠缓冲溶液、10mM亚油酸钠溶液、去离子水和β
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carotene饱和溶液，轻摇混匀，即得。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：王绍东，王遂，姜妍，王晓云，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：