核苷酸序列、fiber2蛋白及表达方法、鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗技术

本发明专利技术提供了核苷酸序列、fiber2蛋白及表达方法、鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗。核苷酸序列，用于编码鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白，其核苷酸序列如SEQ NO：2所示，鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的氨基酸序列如SEQ NO：3所示；将fiber2蛋白基因片段和pET

【技术实现步骤摘要】
核苷酸序列、fiber2蛋白及表达方法、鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及核苷酸序列、fiber2蛋白及表达方法、 鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗。

技术介绍

[0002]目前关于鸭3型腺病毒(DAdV)疫苗相关仅有细胞单苗，鸭坦布苏病毒疫苗 仅有单苗；如专利CN108330108A公布的鸭3型腺病毒疫苗是在原代鸭胚成纤 维细胞(DEF)上增殖后灭活制备的，鸭3型腺病毒和鸭腺病毒2型GR株具有 最高的同源性，由于已报导过鸭Ⅱ型腺病毒的分离株能在原代鸭胚成纤维细胞内 增殖，引起明显的细胞病变，故在可传代鸭胚成纤维细胞扩大培养收获病毒液， 以获得病毒毒价最佳的病毒液，制备原代DEF细胞工艺复杂，易污染，成本较 高；且目前仅有关于鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒单苗的研究和免疫效力评价， 如“鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究”和“鸭坦布苏病毒灭活疫苗的 研制”的介绍能分别制备病毒浓度为10
5.52
TCID50的鸭3型腺病毒疫苗和 10
6.0
TCID50(1倍浓度)的鸭坦布苏病毒灭活疫苗，由于使用浓度技术制备高抗 原含量的疫苗成本较高，加之灭活疫苗单次免疫抗体效价离散度较高，故两种疫 苗在使用中均需对鸭免疫两次，通过增加免疫次数来达到更好的免疫保护力，而 对鸭只反复抓取和免疫，易引起鸭的应激，造成雏鸭的应激死亡和蛋种鸭产蛋急 剧下降。

技术实现思路

[0003]本专利技术的提供一种鸭腺病毒3型HB20株，全基因序列提交Genebank， Accession No：MZ048748。本专利技术还提供了在大肠杆菌上表达和纯化的鸭3型腺 病毒HB20株fiber2蛋白，纯化后蛋白含量达2.0mg/ml，fiber2蛋白具有良好的 免疫原性，与其他类型疫苗相比，生产成本低，产品更加稳定。
[0004]本专利技术的一种核苷酸序列，用于编码鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白， 其中，所述鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2的核苷酸序列如SEQ NO：2所示， 所述鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的核苷酸序列编码得到的鸭3型腺病毒 抗原性片段fiber2蛋白的氨基酸序列如SEQ NO：3所示。
[0005]本专利技术的鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0006]优化设计用于原核表达编码目的基因片段SEQ NO：2的引物fiber
‑
2(opt)
ꢀ‑
F/fiber
‑
2(opt)
‑
R，进行PCR反应，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化得到 fiber2蛋白基因片段；
[0007]一对引物的序列为：
[0008]fiber
‑
2(opt)
‑
F：ggatccATGAAACGTACCAACCGTAGCG；
[0009]fiber
‑
2(opt)
‑
R：ctcgagGAAACATATGAAAACGGAATTGGAC；
[0010]其中一对引物中划线部分的序列分别为BamHI和XhoI酶切位点；
[0011]将fiber2蛋白基因片段和pET
‑
32a载体片段通过T4DNA连接酶连接，获得pET
‑
32a
‑
fiber2重组表达载体；
[0012]将pET
‑
32a
‑
fiber2重组表达载体转化至表达菌株E.coliBL
‑
21(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株；
[0013]培养重组表达菌株，从培养物中获得所述的fiber2蛋白。
[0014]优选地，优化设计所述的一对引物前还包括：
[0015]根据基因片段SEQNO：1对密码子进行优化，调整基因中的低频及稀有密码子，增加高频密码子的使用，使基因的CAI值由0.70提高到0.96，调整基因片段SEQNO：1局部的高GC或AT含量区，消除基因片段SEQNO：1中存在的重复及反向重复序列，设计出基因片段SEQNO：2，根据基因片段SEQNO：2设计所述的一对引物。
[0016]本专利技术的鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗，其使用的抗原包含上述的鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白和灭活的鸭坦布苏病毒；在所述二联灭活疫苗组合物中两种抗原的体积比为1：1；
[0017]所述鸭坦布苏病毒的分类命名为鸭坦布苏病毒DF2株DuckTembusuvirusDF2，其保藏编号为CCTCCNO：V201635，保藏地址为：中国武汉；
[0018]所述鸭坦布苏病毒的含量不低于10
7.5
TCID
50
/0.1ml；鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的含量不低于100μg/ml。
[0019]进一步地，所述鸭坦布苏病毒经过甲醛灭活。
[0020]本专利技术的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0021]将表达纯化的所述fiber2蛋白用灭菌PBS稀释至蛋白浓度为200μg/ml；
[0022]在所述鸭坦布苏病毒DF2株的病毒液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液终浓度为0.2％，边加边搅拌，使其充分混合，置37℃条件下灭活24小时，病毒液中病毒含量为10
7.5
TCID
50
/0.1ml；
[0023]将稀释好的fiber2蛋白和灭活完全的鸭坦布苏病毒液按1:1体积比进行混合，取混合后的96份抗原液，加入灭菌的吐温
‑
804份，搅拌20～30分钟，直到吐温
‑
80完全溶解，即为制苗用的水相；
[0024]将2份油相注入，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后进行剪切乳化；
[0025]乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，贴标签，置2～8℃保存。
[0026]由本专利技术下面的实施例可以看出，本专利技术对鸭3型腺病毒、鸭坦布苏病毒二联灭活疫苗的生产工艺、安全性、保护效果等进行了系列研究，表明该疫苗是安全有效的，对鸭腺病毒3型和鸭坦布苏病毒强毒的攻击，保护率均达到100％。1～2周龄雏鸭通过免疫该疫苗，不仅可同时预防鸭群感染鸭3型腺病毒和鸭坦布苏病毒，而且只需一次免疫即可达到较高抗体水平，抗体持续期可达18个月，避免了反复抓取和免疫鸭只造成的应激。
[0027]本专利技术优化后的fiber2基因与pET
‑
32a质粒重组后表达的蛋白含量高，有利于大量生产鸭3型腺病毒的抗原性fiber2蛋白；本专利技术将鸭坦布苏病毒DF2株在悬浮型BHK
‑
21细胞中传代培养，病毒含量可达10
7.0
TCID
50
/0.1ml以上，因此对于1～2周龄雏鸭，每只0.3ml疫苗的免疫剂量，免疫一次，可使鸭3型腺病毒的中和抗体均不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列，用于编码鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白，其特征在于，所述鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2的核苷酸序列如SEQ NO：2所示，所述鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的核苷酸序列编码得到的鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的氨基酸序列如SEQ NO：3所示。2.一种如权利要求1所述的鸭3型腺病毒抗原性片段fiber2蛋白的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：优化设计用于原核表达编码目的基因片段SEQ NO：2的引物fiber
‑
2(opt)
‑
F/fiber
‑
2(opt)
‑
R，进行PCR反应，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化得到fiber2蛋白基因片段；一对引物的序列为：fiber
‑
2(opt)
‑
F：ggatccATGAAACGTACCAACCGTAGCG；fiber
‑
2(opt)
‑
R：ctcgagGAAACATATGAAAACGGAATTGGAC；其中一对引物中划线部分的序列分别为BamHI和XhoI酶切位点；将fiber2蛋白基因片段和pET
‑
32a载体片段通过T4 DNA连接酶连接，获得pET
‑
32a
‑
fiber2重组表达载体；将pET
‑
32a
‑
fiber2重组表达载体转化至表达菌株E.coli BL
‑
21(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株；培养重组表达菌株，从培养物中获得所述的fiber2蛋白。3.根据权利要求2所述的表达方法，其特征在于，优化设计所述的一对引物前还包括：根据基因片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，姚蓉，徐巧霞，康超，邓明勇，黄运福，杭尧，李国红，王珊，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：