鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的多重标记引物制造技术

本发明专利技术涉及一种快速鉴别香榧新品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。所述分子特征性多重荧光SSR标记引物核苷酸序列如下：引物U7：上游引物Tg_U7F：5

【技术实现步骤摘要】
鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的多重标记引物
(一)

[0001]本专利技术涉及一种快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。
(二)
技术介绍

[0002]香榧隶属红豆杉科(Taxaceae)榧树属(Torreya)植物，是榧树种(Torreya grandis)中的优良变异经人工选育后嫁接繁殖栽培的优良品种，也是目前榧树中唯一进行人工规模栽培的变种。香榧是我国特有的珍贵经济树种，具有食用、药用、材用、绿化等多种用途。
[0003]香榧至今已有1300多年的栽培历史，主要分布于长江流域以南的浙江、江苏、安徽、福建、江西、湖南、湖北、四川、云南和贵州等10省。香榧的实生嫁接繁殖产生了丰富的变异类型，历经多年的优株选育和大批量繁殖试验，浙江省林业育种工作者选育出了多个香榧品种。2011年，良种
‘
细榧
’
(T.grandis
‘
Xifei
’
)通过国家林业局林木品种审定委员会审定。近年来，浙江省审(认)定了
‘
珍珠榧
’
、
‘
大长榧
’
、
‘
象牙榧
’
、
‘
东白珠
’
、
‘
脆仁榧
’
、
‘
朱岩榧
’
、
‘
丁山榧
’
、
‘
东榧1号/>’
、
‘
东榧2号
’
、
‘
东榧3号
’
、
‘
大叶种细榧
’
、
‘
磐安长榧
’
、
‘
玉山鱼榧
’
、
‘
磐大榧
’
等新品种。随着榧树新品种的不断选育和香榧产业的发展壮大，这些新品种的鉴定与知识产权保护也急需相应的分子技术手段跟进。
[0004]香榧品种的鉴别一直是基于传统的形态学上的分类，即根据盛果期香榧果实或种子的性状分为圆籽型(大、中、小圆榧等)和长籽型(细榧、芝麻榧、米榧、茄榧、撩牙榧、旋纹榧等)。这一鉴别方法需要在一年中的果实成熟后才能鉴定选种，无法进行早期鉴别。自2000年以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(随机扩增多态性DNA)、ISSR(简单序列重复区间扩增多态性)和SRAP(相关序列扩增多态性)相继用于了香榧品种分类、遗传变异和居群遗传多样分析。
[0005]然而这些分子标记所采用的均为通用型引物，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，需经过大量的筛选工作，因此并不适合于品种鉴别。SSR(简单重复序列；或Microsatellite，微卫星)为共显性标记，能区分纯合子和杂合子，能检测复等位基因，且具有多态性丰富、操作简单、结果可靠、重复性好等优点。近年来，有基于榧树转录组测序开发SSR标记的报道，但这些SSR标记的可用性是基于传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳，对条带的人工判读误差较大，难以准确区别出SSR位点上等位基因在几个碱基上的差异；而且这些SSR标记也尚未进行多态性筛选工作，因此是否可用于香榧品种的准确快速鉴别不得而知。
[0006]荧光SSR标记的开发是基于DNA测序平台的毛细管电泳检测方法，是以不同颜色的荧光基团(如FAM、HEX、TAMRA等)来标记一对SSR引物中的一个引物末端，利用荧光检测器对产物检测，达到自动识别扩增产物的大小，克服了传统银染法聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的不足，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。荧光多重SSR标记技术则进一步结合了多重PCR(Multiplex PCR)与荧光SSR标记二项技术的优点，可以在一个PCR反应体系中加入多对
SSR引物组合，可以同时检测出多个基因型，从而解决了在进行大批量、多批次检测时的费时费力以及成本高的缺陷。
[0007]因此，利用多重荧光SSR标记技术开发香榧新品种或优良、特色品种的特征SSR指纹(基因型)，揭示品种间的基因型差异，对于品种的鉴别与知识产权保护具有重要意义。但迄今为止，国内外尚无利用多重荧光SSR标记技术开发特征SSR指纹鉴别香榧品种的报道。
(三)
技术实现思路

[0008]本专利技术目的是提供一种快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的分子特征性多重荧光SSR标记引物及方法。
[0009]本专利技术采用的技术方案是：
[0010]用于鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的2对分子特征性多重荧光SSR引物，其核苷酸序列如下：
[0011]引物U7：
[0012]上游引物Tg_U7F：5
′‑
FAM
‑
CGCCTCTAACCATGTCCACT
‑3′
[0013]下游引物Tg_U7R：5
′‑
AAATTCCAGGGAAACAAAAGAA
‑3′
[0014]引物U734：
[0015]上游引物Tg_U734F：5
′‑
HEX
‑
CTATGAGCGGTGGAACCCTA
‑3′
[0016]下游引物Tg_U734R：5
′‑
GTGGGAGAAATGCCACAACT
‑3′
。
[0017]该引物对组合是基于荧光SSR标记技术，经过对大量自主开发的SSR引物在待测香榧品种间进行多态性筛选试验后获得的。利用该多重荧光SSR引物对对9个香榧品种进行检测，3个香榧新品种(玉山鱼榧、大丁香和磐大榧)可稳定获得3种不同的SSR特征指纹(基因型)，而其他香榧品种均不具备这3种特征，因此该引物组可用于快速鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧。需要说明的是，本专利技术分子特征性多重荧光SSR引物仅限于香榧品种的鉴别(鉴别其是否为玉山鱼榧、大丁香和磐大榧)，即待测样品仅限于香榧品种。
[0018]本专利技术还涉及一种鉴别3个香榧新品种的方法，所述方法包括：提取待测香榧品种针叶的基因组DNA作为模板，以分子特征性多重荧光SSR引物对Tg_U7F/Tg_U7R和Tg_U734F/Tg_U734R作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对SSR扩增产物进行毛细管电泳检测，若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为289/295和192/222，则待测香榧品种为玉山鱼榧；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为277/289/295和192/216，则待测香榧品种为大丁香；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为277/295和192/216，则待测香榧品种为磐大榧，反之则否；
[0019]所述分子特征性多重荧光SSR引物核苷酸序列如下：
[0020]引物U7：
[0021]上游引物Tg_U7F：5
′‑
FAM
‑
CGCCTCTAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴别香榧品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的分子特征性多重荧光SSR标记引物，其核苷酸序列如下：引物U7：上游引物Tg_U7F：5
′‑
FAM
‑
CGCCTCTAACCATGTCCACT
‑3′
下游引物Tg_U7R：5
′‑
AAATTCCAGGGAAACAAAAGAA
‑3′
；引物U734：上游引物Tg_U734F：5
′‑
HEX
‑
CTATGAGCGGTGGAACCCTA
‑3′
下游引物Tg_U734R：5
′‑
GTGGGAGAAATGCCACAACT
‑3′
。2.一种快速鉴别香榧新品种玉山鱼榧、大丁香和磐大榧的方法，所述方法包括：提取待测香榧品种针叶的基因组DNA作为模板，以分子特征性多重荧光SSR引物作为扩增引物，进行多重PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为289/295和192/222，则待测香榧品种为玉山鱼榧；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为277/289/295和192/216，则待测香榧品种为大丁香；若荧光毛细管电泳峰图上显示的基因型为277/295和192/216，则待测香榧品种为磐大榧，反之则否；所述分子特征性多重荧光SSR引物核苷酸序列如下：引物U7：上游引物Tg_U7F：5
′‑
FAM
‑
CGCCTCTAACCATGTCCACT
‑3′
下游引物Tg_U7R：5
′‑
AAATTCCAGGGAAACAAAAGAA
‑3′
；引物U734：上游引物Tg_U734F：5
′‑
HEX
‑
CTATGAGCGGTGGAACCCTA
‑3′
下游引物Tg_U734R：5
′‑
GTGGGAGAAATGCCACAACT
‑3′
。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述多重PCR扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，57.8℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：张苏炯，陈红星，李海波，沈建军，叶碧欢，宋其岩，陈友吾，胡传久，
申请(专利权)人：磐安县自然资源和规划局浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：