紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法，包括菌种培养、过表达载体构建、过表达质粒转化等步骤。本发明专利技术成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的comp53355_c10基因，验证其存在，并将该基因与过表达质粒pBARGPE1

【技术实现步骤摘要】
紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法，属于生物基因工程领域。

技术介绍

[0002]红曲菌又称“红曲霉”，是一种腐生真菌，在真菌分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，不整子囊菌纲，红曲菌科，红曲霉属。红曲菌作为重要的食用和药用真菌之一，可产生多种次级代谢产物，包括Monacolin K、红曲色素、桔霉素、γ
‑
氨基丁酸以及麦角固醇等，其中大部分被广泛应用于食品、医药等领域。Monacolin K又称“洛伐他汀”，是红曲菌产生的一种具有生理活性的聚酮类物质。研究发现，Monacolin K具有抑制胆固醇合成途径中的关键酶HMG
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CoA还原酶(3
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羟基
‑3‑
甲基
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戊二酰辅酶A还原酶)活性的作用，进而能够有效的抑制胆固醇合成，因此，Monacolin K被国内外视为降胆固醇的理想药。
[0003]本专利技术的申请人实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析，发现了52个转录因子和27个靶基因，对其中的5个转录因子和5个靶基因进行了基因功能的预测并获得了相关的基因信息。由于红曲菌生物合成及分解代谢过程繁杂，Monacolin K具体调控机制还未完全清晰，可对上述转录因子和靶基因进行基因克隆、功能验证等工作，以期获得红曲菌次级代谢产物合成过程中的关键调控因子。
[0004]本专利技术选取转录组测序所得到的一个上调基因comp53355_c10进行基因克隆，并构建该基因过表达工程菌株，探究目的基因的过表达对红曲菌Monacolin K的合成、红曲色素的合成、菌丝体形态、生物量及相关基因表达量的影响。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法。
[0006]在申请人前期的研究中，实验室前期利用高通量测序技术对紫色红曲菌M1的转录组进行分析，发现comp53355_c10基因对提高红曲菌monacolink产量具有积极作用。
[0007]comp53355_c10基因序列基因序列(全长261bp)：
[0008]GGCAATCAGAGTTTCTATGGAATATCAAACGGGATACTGTAGGCTCTCTTCTATCCACACATTGCATCCTTCCTACGCCGTACACTGCACGTTTCATCGAAGCGGCGCCGACTGGAAGGTAGAACGCTCTACAGAAGTGAGCTGGTGGATTCGGCAGCGGGGGAACATTCGATAAGAAATAAGGTCACCGTACGATTCGTTTCAGCCAGCATTATTATTATTACTTATTTGCGAATGACCTTACAGTGCTTACATTCCAAG。
[0009]本专利技术提供一种紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株，可以显著提高Monacolin K表达产量。
[0010]本专利技术还提供了紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：
[0011](一)菌种培养
[0012]将紫色红曲菌M1菌株在PDA培养基上培养，活化2代后接种，每代3
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4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养48h至种子液培养基呈浅粉色，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度调整为25℃继续培养13d。
[0013]分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于
‑
80℃冰箱中保存。
[0014](二)红曲菌总RNA的提取
[0015]具体步骤如下：
[0016]1.在2mL离心管中，加入475μL SL和25μL的β
‑
巯基乙醇，取于
‑
80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取100mg粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，以12000rpm的转速离心2min；
[0017]2.在CS过滤柱内加入适量的上清液，12000rpm离心2min后吸取上清液至新的离心管中；
[0018]3.取160μL无水乙醇加入上清液中混匀，将混合液转移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；
[0019]4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；
[0020]5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；
[0021]6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；
[0022]7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；
[0023]8.重复一次步骤7；
[0024]9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase
‑
Free ddH2O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA；
[0025](三)RNA质量检测
[0026]1.利用NanoDrop 2000核酸定量仪进行RNA浓度、纯度检测，具体步骤如下：准确吸取1μL的RNase
‑
Free ddH2O，点样于NanoDrop核酸定量仪的检测孔中作为空白对照。取1μLRNA，点样于检测孔，得到RNA浓度及用于衡量蛋白质污染程度的OD值；
[0027]2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：
[0028](1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取5μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样；
[0029](2)电泳仪电压为150V，时间为15min；通过凝胶成像仪检测RNA完整性；
[0030](四)cDNA的反转录
[0031](1)根据下表的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，3min；取出放于冰上备用；
[0032]组成成分使用量5
×
gDNA Buffer2μLTotal RNA2μL
RNase
‑
Free ddH2O6μL
[0033](2)根据下表的体系配制混合液，吸打混匀，待用；
[0034]组成成分使用量10
×
Fast RT Buffer2μLRT Enzyme M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.紫色红曲菌中comp53355_c10基因在提高monacolin K产量上的应用。2.一种紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株。3.紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：(一)菌种培养将紫色红曲菌M1菌株在PDA培养基上培养，活化2代后接种，每代3
‑
4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养48h至种子液培养基呈浅粉色，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度调整为25℃继续培养13d；分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于
‑
80℃冰箱中保存；(二)红曲菌总RNA的提取具体步骤如下：1.在2mL离心管中，加入475μL SL和25μL的β
‑
巯基乙醇，取于
‑
80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取100mg粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，以12000rpm的转速离心2min；2.在CS过滤柱内加入适量的上清液，12000rpm离心2min后吸取上清液至新的离心管中；3.取160μL无水乙醇加入上清液中混匀，将混合液转移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；8.重复一次步骤7；9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase
‑
Free ddH2O加到CR3吸附柱膜的中央，静置2min，12000rpm离心1min，滤液即为所提RNA；(三)RNA质量检测1.利用NanoDrop 2000核酸定量仪进行RNA浓度、纯度检测，具体步骤如下：准确吸取1μL的RNase
‑
Free ddH2O，点样于NanoDrop核酸定量仪的检测孔中作为空白对照；取1μL RNA，点样于检测孔，得到RNA浓度及用于衡量蛋白质污染程度的OD值；2.采用电泳检测RNA的完整性，具体步骤如下：(1)于封口膜上点1μL的10X Loading Buffer载样缓冲液，吸取5μLRNA样品与缓冲液混合，吸打混匀后点样；(2)电泳仪电压为150V，时间15min；通过凝胶成像仪检测RNA完整性；(四)cDNA的反转录(1)根据下表的去除体系配制混合液，离心3sec，然后于PCR仪中反应，反应条件：42℃，
3min；取出放于冰上备用；组成成分使用量5xgDNA Buffer2μLTotal RNA2μLRNase
‑
Free ddH2O6μL(2)根据下表的体系配制混合液，吸打混匀，待用；组成成分使用量1OxFast RT Buffer2μLRT Enzyme Mix1μLFQ
‑
RT Primer Mix2μLRNase
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Free ddH2O5μL(3)取步骤(2)配制好的混合液10μL加到步骤(1)的溶液中，短暂离心；(4)混合液42℃孵育15min，然后再于95℃孵育3min，则完成反转录，得到cDNA溶液于
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20℃保存；(五)引物设计根据comp53355_c10基因序列，引物及序列如下：(六)过表达载体构建以pBARGPE1
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Hygro为过表达载体，选出该载体上的两个单一酶切位点，通过双酶切将扩增出的comp53355_c10目的基因进行连接，构建过表达pBARGPE1
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Hygro
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c10质粒；(1)comp53355_c10基因的扩增根据红曲菌转录组所得comp53355_c10基因序列设计PCR引物，以紫色红曲菌的cDNA为模板进行扩增comp53355_c10基因；comp53355_c10基因的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：PCR反应体系体积(μL)PrimeSTAR Max Premix(2X)12.5c10
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F1c10
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R1cDNA1ddH2O9.5总体积25PCR反应条件：1)95℃for 5min；2)94℃for 30sec；
3)62℃for 30sec；4)72℃for 10sec；5)GOTO 2,30more times；6)72℃for 10min；7)4℃,forever；(2)PCR产物纯化回收具体步骤如下：1.每100μL PCR体系加入500μL DB，充分混匀；(若体系小于100μL，可用双蒸水补足到100μL)；2.将上述混合溶液全部转移到吸附柱AC中，室温静置1min，12000rpm离心30
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60sec，弃滤液；3.加入700μL WB漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婵，王成涛，孙宝国，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：