检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR引物及其试剂盒


[0001]本专利技术属于新型阿卡斑病毒检测领域，尤其涉及检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR引物及其试剂盒。

技术介绍

[0002]阿卡斑病毒(Akabane vrius,AKAV)是阿卡斑病(又称赤羽病)病原，该病是一种虫媒性传染病，可导致牛、羊流产、死胎、胎儿畸形，并通过垂直传播，侵害胎儿中枢神经，造成积水性无脑综合症和新生胎儿关节弯曲；主要流行于热带、亚热带及温带地区，如亚洲、非洲的部分国家和大洋洲，并在我国多省广泛流行，严重威胁动物健康，因此被列为国际动物贸易的重点检疫对象、我国二类动物疫病和我国进口牛、羊必检7种疫病之一。
[0003]AKAV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群，为分节段单股负链RNA病毒，基因组全长12kb，由S、M、L共3个基因节段构成。S基因编码核衣壳蛋白，高度保守；M基因编码病毒囊膜糖蛋白，高度变异；L基因编码具有RNA酶活性的L蛋白，变异程度仅次于M蛋白。根据S、M基因进化分析，可将全球分离到的AKAV分为4个基因型，其中基因I型可分为Ia、Ib两个亚型。
[0004]除牛、羊外，AKAV可以感染马、水牛、骆驼，还可以在猪、兔、野牛、河马、长颈鹿、大象、大羚羊甚至灵长动物等十几种家畜、野生动物中检出AKAV抗体。2016年申请人在竹鼠中分离到新型阿卡斑病毒并申请中国专利(“用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的RT
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PCR引物及其试剂盒”，专利号ZL201710372744.X，公开日2017.05.24)，该研究首次证实AKAV可以感染啮齿动物，而且与传统毒株相比，该毒株发生一定程度变异，临床症状也有变化，说明新型阿卡斑病毒在宿主范围和致病力上发生改变。随后，云南、广东、湖南、海南等省相继在牛、蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊中发现与新型阿卡斑病毒同源性高的AKAV毒株，说明该毒株可能已在一定范围内流行，十分有必要加强对新型阿卡斑病毒的监控。
[0005]前述专利公开了采用普通RT
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PCR检测新型阿卡斑病毒，其最低检测限109copies/μL。而蚊虫中病毒拷贝数往往较低，低于传统PCR方法检测限。因此，有必要开发一种敏感性更高的新型阿卡斑病毒检测技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、快速且可定量的检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR引物及其试剂盒。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR引物，包括引物AKAVMF1和引物AKAVMR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。
[0009]引物AKAVMF1和引物AKAVMR1的摩尔比为1:1。
[0010]上述荧光定量RT
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PCR引物在扩增新型阿卡斑病毒M基因中的应用。
[0011]扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、66℃30s、72℃30s共40个循环。
[0012]检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR试剂盒，含有引物AKAVMF1和引物AKAVMR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。
[0013]引物AKAVMF1和引物AKAVMR1浓度均为10μM。
[0014]该试剂盒还包括以下试剂：RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量RT
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PCR扩增试剂、新型阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照。
[0015]RNA提取试剂、反转录试剂分别为Takara的MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒(9767)和PrimeScript RT Master Mix(RR036Q)，荧光定量RT
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PCR扩增试剂为SYBR Premix Ex Taq II(RR820A)；阳性对照为新型阿卡斑病毒M基因片段的质粒，阴性对照为新型阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。
[0016]上述荧光定量RT
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PCR试剂盒在扩增新型阿卡斑病毒M基因中的应用。
[0017]扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、66℃30s、72℃30s共40个循环。
[0018]针对目前新型阿卡斑病毒PCR检测存在的问题，结合新型阿卡斑病毒M基因的特点，专利技术人设计并制备了检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR引物，包括引物AKAVMF1和引物AKAVMR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，专利技术人还建立相应的荧光定量RT
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PCR检测方法并制备相应的荧光定量RT
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PCR试剂盒。实验表明，本专利技术具有特异、敏感、快速、简便的特点，而且检测灵敏度高，在标准品为1.0
×
102～1.0
×
10
10
copies/μL范围内都有较好的线性关系。与前述专利相比，本专利技术检测限低至1.0
×
102copies/μL、检测范围宽至9个数量级，灵敏度是普通RT
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PCR的107倍，可以从拷贝数低的样品中快速、高效检测新型阿卡斑病毒，满足动物疫病监测、防控的需求，填补了目前临床新型阿卡斑病毒荧光定量检测方法空白，具有较好的应用前景。
附图说明
[0019]图1是新型阿卡斑病毒M基因荧光定量RT
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PCR标准曲线，图中：横轴为重组质粒标准品拷贝数的对数值，纵轴为Ct值。
[0020]图2是新型阿卡斑病毒M基因荧光定量RT
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PCR特异性检测结果图，图中：1
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3是新型阿卡斑病毒细胞培养上清(3个重复)，4
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15分别是蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌(各3个重复)。
具体实施方式
[0021]实施例1引物设计
[0022]根据Genbank的新型阿卡斑病毒GXLCH16
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70毒株的M基因保守区(登录号KY381280)，用Primer 5.0等软件设计引物AKAVMF1和AKAVMR1、AKAVMF2和AKAVMR2(SEQ.ID.NO.1
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SEQ.ID.NO.4)，由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成，用DEPC ddH2O溶解，
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20℃保存。
[0023]表1引物序列
[0024][0025]实施例2荧光定量RT
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PCR检测方法的建立
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR引物，其特征在于包括引物AKAVMF1和引物AKAVMR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。2.根据权利要求1所述的荧光定量RT
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PCR引物，其特征在于所述引物AKAVMF1和引物AKAVMR1的摩尔比为1:1。3.权利要求1所述的荧光定量RT
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PCR引物在扩增新型阿卡斑病毒M基因中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、66℃30s、72℃30s共40个循环。5.一种检测新型阿卡斑病毒M基因的荧光定量RT
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PCR试剂盒，其特征在于含有引物AKAVMF1和引物AKAVMR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。6.根据权利要求5所述的荧光定量RT
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PCR试剂盒，其特征在于：所述引物AKAVMF1和引物AKAVMR1浓度均...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：