麦长管蚜杀虫剂或抗生素处理下稳定表达内参基因SA-28S部分序列、克隆方法及应用技术

本发明专利技术公开了麦长管蚜杀虫剂或抗生素处理下稳定表达内参基因SA

【技术实现步骤摘要】
麦长管蚜杀虫剂或抗生素处理下稳定表达内参基因SA
‑
28S部分序列、克隆方法及应用
[0001]本申请为申请号201910608195.0(专利技术名称：麦长管蚜内参基因的部分序列、克隆方法及应用)的分案申请。


[0002]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及麦长管蚜内参基因SA
‑
HEL基因、SA
‑
RPL14基因、SA
‑
SA
‑
RPL11基因或SA
‑
28S基因部分序列、克隆方法及其作为内参基因在RT
‑
qPCR中的应用。

技术介绍

[0003]麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)属同翅目，蚜科，是我国麦类作物的主要害虫之一，其寄主种类较多，除为害小麦、大麦、燕麦等麦类作物外，也为害水稻、高粱、玉米、甘蔗等其他禾本科作物以及早熟禾、看麦娘、马唐、棒头草、狗尾草、白羊草等禾本科、莎草科杂草。具有分布广、数量大、繁殖力强的特点，影响小麦植株的正常生长，导致小麦产量严重下降，给农业生产造成巨大损失。一般年份可使小麦减产5.1％～16.5％，大发生年份小麦减产40％以上。一般蚜虫都是无翅的，可受外界环境条件和生物因素调节生成有翅蚜和无翅蚜，有翅型个体可远距离迁飞寻找寄主植物，除直接刺吸小麦汁液外，还是传播麦类病毒病的重要媒介。
[0004]麦长管蚜无翅孤雌蚜体长3.1mm，宽1.4mm，长卵形，草绿色至橙红色，头部略显灰色，腹侧具灰绿色斑。触角、喙端节、跗节、腹管黑色，尾片色浅。腹部第六至八节及腹面具横网纹，无缘瘤。中胸腹岔短柄。额瘤显著外倾。触角细长，全长不及体长，第三节基部具1～4个次生感觉圈。喙粗大，超过中足基节，端节圆锥形，是基宽的1.8倍。腹管长圆筒形，长为体长的1/4，在端部有十几行网纹。尾片长圆锥形，长为腹管的1/2，有6～8根曲毛。有翅孤雌蚜体长3.0mm，椭圆形，绿色，触角黑色，第三节有8～12个感觉圈排成1行。喙不达中足基节。腹管长圆筒形，黑色，端部具15～16行横行网纹。前翅中脉三叉，分叉大。
[0005]在昆虫基因转录水平的研究中，实时荧光定量PCR技术(qRT
‑
PCR)是一种检测特定基因mRNA表达水平和转录分析的有效手段。qRT
‑
PCR技术具有实时检测、特异性强、快速灵敏、准确定量的优点，实现了传统PCR从定性到精准定量的飞跃。进行qRT
‑
PCR试验时，内参基因必须在给定的实验条件下稳定表达。为促进基因表达研究，获得更准确的表达量数据，筛选相对稳定的内参基因是必要的基础工作。理想的内参基因要求不受外界任何环境因素影响，在不同实验条件下均能稳定表达。但是，大量研究表明，不存在绝对稳定表达的基因(Xun,Z et al.,.Selection and Evaluation of Reference Genes for Expression Analysis Using qRT
‑
PCR in the Beet Armyworm Spo
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doptera exigua(Lepidoptera:Noctuidae)PLoS ONE,2014,9(1):e84730.doi:10.1371/journal.pone.0084730.；Shakeel,M.,et al.,Gene expression studies of reference genes for quantitative real
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time PCR:an overview in insects.Biotechnology Letters,2017.40(2):p.227
‑
236.)。目前，常用的昆虫内参基因有：18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S rRNA)、延伸因子1(Elongationfactor
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1alpha，EF1
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a)、β
‑
肌动蛋白基因(Beta actin，β
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actin)、28S核糖体RNA(28S ribosomal RNA，28S rRNA)、β
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微管蛋白(Beta tubulin)、琥珀酸脱氢酶复合体A亚基(Succinate dehydrogenase complex subunitA，SDHA)核糖体蛋白S27 Ribosomal protein S27(rsp27)、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(GAPDH)和TATA盒结合蛋白(TATA
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Box binding protein)等(Xun,Z et al.,.Selection and Evaluation of Reference Genes for Expression Analysis Using qRT
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PCR in the Beet Armyworm Spo
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doptera exigua(Lepidoptera:Noctuidae)PLoS ONE,2014,9(1):e84730.doi:10.1371/journal.pone.0084730.；Shakeel,M.,et al.,Gene expression studies of reference genes for quantitative real
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time PCR:an overview in insects.Biotechnology Letters,2017.40(2):p.227
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236.)这些基因在细胞中参与正常的生命代谢。在昆虫样本体内，同一基因在不同种类昆虫中的功能、表达水平存在差异。同样，候选内参基因的表达情况也会因为不同昆虫物种或不同实验条件而存在差异。随着qRT
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PCR技术的广泛应用，研究发现，昆虫样品种类和实验条件的不同，持家基因的表达量在某些特定条件下会发生较大的变化，如果盲目地借鉴，可能影响最终定量结果的准确性。SA
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HEL(解旋酶，SA
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HELicase)一种广泛存在于多种生物体内的，可以解开氢键的酶，一般在DNA或RNA复制过程中起到催化双链DNA或RNA解旋的作用。解旋酶属于分子伴侣，对于确保DNA或RNA的正确折叠以及保存和修饰其特定的二级、三级结构必不可少。SA
‑
HEL基因是在生物体内非常保守持家基因。通过定量PCR检测表明该基因在麦长管蚜的生长发育的各个时期以及有翅蚜和无翅蚜体内均能稳定表达，为研究麦长管蚜功能基因及在不同发育时期、有翅蚜和无翅蚜体内的表达研究提供了非常理想的内参基因。RPL14(核糖体蛋白质，Ribosomal protein L14)是组成核糖体的主要成分,在细胞内蛋白质生物合成中发挥重要作用。核糖体蛋白质广泛分布于各种组织中,它们与核糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种麦长管蚜基因片段，其特征在于，所述基因片为SA
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28S基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。2.一种麦长管蚜基因部分序列的克隆方法，其特征在于，步骤如下：：提取麦长管蚜基因组总RNA，以试剂盒自带混合引物为反应引物进行RT反应，以产物第一链cDNA作为模板、以引物SA
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28S
‑
F/SA
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28S
‑
R进行RT
‑
PCR扩增，得到阳性克隆，最后经测序验证，其中所述引物对序列如下：SA
‑
28S
‑
F：5
’‑
CGAGTGAGCCAGAAACACAT
‑3’ꢀ
；SA
‑
28S
‑
R：5
’‑
ATCCCCAGTCTTTGGCCTTTT
‑3’
。3.根据权利要求2所述的克隆方法，所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性5min后；94℃变性30sec，60℃退火30sec，每个循环降0.5℃，72℃延伸1mim，共30个循环；94℃再变性30sec，45℃再退火30sec， 72℃再延伸1mim，共10个循环...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱勋，张云慧，高海峰，李祥瑞，阎维巍，程登发，李新安，任智萌，龚培盼，王超，魏长平，杨超霞，李亚萍，殷新田，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：