【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合并的敲入筛选和在内源基因座控制下共表达的异源多肽
[0001]在先相关申请
[0002]本申请要求于2019年3月14日提交的美国临时申请第62/818,535号、2019年3月14日提交的美国临时申请第62/818,578号、2019年7月8日提交的美国临时申请第62/871,309号、2019年7月8日提交的美国临时申请第62/871,467号的权益,所有这些申请都通过引用整体并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]免疫细胞疗法已经发展了三十多年。从传统的随机整合病毒基因修饰方法到靶向非病毒整合的演变为进一步释放细胞免疫疗法的潜力提供了广阔的前景。然而,靶向整合所特有的关键工程挑战仍然存在,例如预测不同靶位点的效率和开发高通量筛选平台以快速测试被靶向以插入细胞的基因组基因座中的合并的DNA序列。快速鉴定细胞中的靶向基因组整合的选择有限。
[0005]此外,用于治疗用途的离体或活体基因编辑细胞修饰的当前技术集中在校正现有突变、限制由导致功能错误基因的单个突变引起的疾患的治疗适用性、或整合全新的合成基因,需要广泛的研究和开发来产生新的治疗有用的合成DNA序列。因此,基因组修饰的选择有限。鉴于T细胞在过继细胞疗法中的重要性,获得人类T细胞并对其进行修饰以产生具有所需功能的编辑T细胞的能力可有利于过继T细胞疗法的开发和应用。
技术实现思路
[0006]合并的敲入筛选(Pooled Knock
‑
In Screening)
[0007]本公开涉及用于鉴定细胞基因组中的靶向 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于鉴定细胞的基因组中的靶向插入的方法,所述方法包括:(a)向细胞群体中引入:(i)切割所述细胞的所述基因组中的靶区域以产生靶插入位点的靶向核酸酶;和(ii)序列彼此不同的多个DNA模板,其中每个DNA模板包含:i.异源编码或非编码核酸序列;ii.指示所述异源编码或非编码核酸序列的身份的独特条形码核苷酸序列;和iii.共同引物结合序列,其中每个DNA模板的5
′
端和3
′
端包含与所述靶插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列,并且其中一个或两个同源核苷酸序列与所述基因组序列中的同源序列相比包含错配核苷酸序列,其中所述错配核苷酸序列在重组期间不插入到所述靶插入位点中;(b)允许重组发生,从而产生修饰细胞群体;(c)用一对引物从所述细胞扩增DNA以生成扩增的DNA,其中第一引物与所述共同引物结合序列互补,并且其中第二引物与所述插入位点侧翼的所述基因组序列中的所述同源序列结合并且不与所述DNA模板中的所述错配核苷酸序列结合;或者其中第一引物与所述插入位点侧翼的5
′
基因组区域中的第一同源序列结合并且不与所述DNA模板中与所述第一同源序列在相同位置的错配序列结合,而第二引物与所述插入位点侧翼的3
′
基因组区域中的第二同源序列结合并且不与所述DNA模板中与所述第二同源序列在相同位置的错配核苷酸序列结合;以及(f)对所述扩增的DNA进行测序以鉴定插入细胞的所述靶插入位点中的DNA模板。2.如权利要求1所述的方法,其中所述错配核苷酸序列的长度为约3至40个核苷酸。3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述条形码序列在所述扩增的DNA中并且对所述条形码序列进行测序。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法,所述方法还包括确定所述群体中具有插入所述靶插入位点中的不同DNA模板的细胞的相对数量。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法,所述方法还包括向所述修饰细胞群体施加选择压力。6.如权利要求5中任一项所述的方法,所述方法还包括比较在对所述细胞施加选择压力之前和之后所述群体中具有插入所述靶插入位点中的不同DNA模板的细胞的相对数量。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的方法,其中通过将包含所述DNA模板的病毒载体引入所述细胞中来插入所述DNA模板。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法,其中所述群体是哺乳动物细胞群体。9.如权利要求8所述的方法,其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。10.如权利要求9所述的方法,其中所述人类细胞是T细胞。11.如权利要求10所述的方法,其中所述T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或原初T细胞。12.如权利要求10或11所述的方法,其中所述效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。13.如权利要求12所述的方法,其中所述效应T细胞是CD8+CD4+T细胞。14.如权利要求1
‑
13中任一项所述的方法,其中所述细胞是原代细胞。
15.如权利要求1
‑
14中任一项所述的方法,其中所述DNA模板包含编码异源多肽的核酸。16.如权利要求10
‑
15中任一项所述的方法,其中所述DNA模板包含权利要求21
‑
31中任一项所述的核酸构建体。17.如权利要求1
‑
16中任一项所述的方法,其中所述靶插入位点在TCR
‑
α亚基恒定基因(TRAC)的外显子1或TCR
‑
β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中。18.如权利要求17所述的方法,其中所述基因组序列是人T细胞TCR基因座序列。19.如权利要求1
‑
18中任一项所述的方法,其中所述靶向核酸酶选自由以下组成的组:RNA指导的核酸酶结构域、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。20.如权利要求19所述的方法,其中将所述靶向核酸酶、指导RNA和所述DNA模板作为核糖核蛋白复合物(RNP)
‑
DNA模板复合物引入所述细胞中,其中所述RNP
‑
DNA模板复合物包含:(i)所述RNP,其中所述RNP包含所述靶向核酸酶和所述指导RNA;和(ii)所述DNA模板。21.一种包含编码多肽的编码核苷酸序列的核酸构建体,其中每个DNA模板的5
′
端和3
′
端包含与细胞的基因组中的插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列,其中一个或两个同源核苷酸序列与所述细胞中的同源基因组序列相比包含错配核苷酸序列;并且其中所述错配核苷酸序列的长度足以防止与对应于所述错配核苷酸序列的所述基因组序列特异性结合的引物的结合。22.如权利要求21所述的核酸构建体,其中所述编码核苷酸序列包含由自切割肽的编码序列的编码序列连接的两个异源编码序列。23.如权利要求21或22所述的核酸构建体,其中所述错配核苷酸序列的长度为约3至约40个核苷酸。24.如权利要求21
‑
23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:(i)第一自切割肽序列;(ii)第一异源TCR亚基链,其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基的可变区和恒定区;(iii)第二自切割肽序列;(iv)多肽;(v)第三自切割肽序列;(vi)第二异源TCR亚基链的可变区;和(vii)内源TCR亚基的N末端的一部分,其中所述核酸构建体包含条形码序列,其中插入序列是T细胞的TCR基因座,其中一个或两个同源核苷酸序列包含错配核苷酸序列,并且其中如果所述内源TCR亚基是TCR
‑
alpha(TCR
‑
α)亚基,则所述第一异源TCR亚基链是异源TCR
‑
beta(TCR
‑
β)亚基链并且所述第二异源TCR亚基链是异源TCR
‑
α亚基链,而其中如果所述内源TCR亚基是TCR
‑
β亚基,则所述第一异源TCR亚基链是异源TCR
‑
α亚基链并且所述第二异源TCR亚基链是异源TCR
‑
β亚基链。25.如权利要求21
‑
23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:(i)第一自切割肽序列;
(ii)多肽(iii)第二自切割肽序列;(iv)第一异源TCR亚基链,其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基的可变区和恒定区;(v)第三自切割肽序列;(vi)第二异源TCR亚基链的可变区;和(vii)内源TCR亚基的N末端的一部分,其中所述核酸构建体包含条形码序列,其中插入序列是人T细胞的TCR基因座,其中一个或两个同源核苷酸序列包含错配核苷酸序列,并且其中如果所述内源TCR亚基是TCR
‑
alpha(TCR
‑
α)亚基,则所述第一异源TCR亚基链是异源TCR
‑
beta(TCR
‑
β)亚基链并且所述第二异源TCR亚基链是异源TCR
‑
α亚基链,而其中如果所述内源TCR亚基是TCR
‑
β亚基,则所述第一异源TCR亚基链是异源TCR
‑
α亚基链并且所述第二异源TCR亚基链是异源TCR
‑
β亚基链。26.如权利要求21
‑
23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:(i)第一自切割肽序列;(ii)第一异源TCR亚基链,其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基的可变区和恒定区(iii)第二自切割肽序列;(iv)第二异源TCR亚基链,其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基的可变区和恒定区(v)第三自切割肽序列;(vi)多肽;和(vii)第四自切割肽序列或polyA序列,其中所述核酸构建体包含条形码序列,插入序列是人T细胞的TCR基因座,其中一个或两个同源核苷酸序列包含错配核苷酸序列,并且其中如果所述内源TCR亚基是TCR
‑
alpha(TCR
‑
α)亚基,则所述第一异源TCR亚基链是异源TCR
‑
beta(TCR
‑
β)亚基链并且所述第二异源TCR亚基链是异源TCR
‑
α亚基链,而其中如果所述内源TCR亚基是TCR
‑
β亚基,则所述第一异源TCR亚基链是异源TCR
‑
α亚基链并且所述第二异源TCR亚基链是异源TCR
‑
β亚基链。27.如权利要求21
‑
23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:(i)第一自切割肽序列;(ii)合成抗原受体;(iii)第二自切割肽序列;(iv)异源多肽;和(v)第三自切割肽序列或polyA序列,其中所述核酸构建体包含条形码序列,其中插入序列是人T细胞的TCR基因座。28.如权利要求21
‑
23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:(i)第一自切割肽序列;(ii)多肽(iii)第二自切割肽序列;(iv)合成抗原受体;和(v)第三自切割肽序列或polyA序列,其中所述核酸构建体包含条形码序列,其中插入序列是人T细胞的TCR基因座。29.如权利要求21
‑
23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:
(i)第一自切割肽序列;(ii)第一TCR β或α亚基链,其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基链的可变区和恒定区;(iii)第二自切割肽序列;(iv)第二TCR β或α亚基链,其中所述第二TCR亚基链不同于所述第一TCR亚基链,其中所述TCR亚基链包含所述TCR亚基的可变区和恒定区;和;或所述TCR亚基包含所述亚基的可变区;和(v)第三自切割肽序列或polyA序列,其中所述核酸构建体包含条形码序列,其中插入序列是人T细胞的TCR基因座。30.如权利要求21
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23中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体按以下顺序编码:(i)第一自切割肽序列;(ii)合成抗原受体;和(iii)第二自切割肽序列或polyA序列,其中所述核酸构建体包含条形码序列,其中插入序列是人T细胞的TCR基因座。31.如权利要求27、28或30中任一项所述的核酸构建体,其中所述合成抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或SynNotch受体。32.如权利要求21
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31中任一项所述的核酸构建体,其中所述构建体包含一个或多个指示所述多肽的身份的条形码序列。33.如权利要求21
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32中任一项所述的核酸构建体,其中一个或多个接头序列将所述核酸构建体的组分隔开。34.如权利要求33所述的核酸构建体,其中所述一个或多个接头序列具有相同的序列。35.如权利要求32所述的核酸构建体,其中所述构建体包含在编码所述多肽的所述核苷酸序列侧翼的一对独特条形码。36.如权利要求32或35所述的核酸构建体,其中所述一个或多个条形码位于所述自切割肽序列或polyA序列之前、之后或之中。37.一种文库,所述文库包含两个或更多个权利要求21
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36中任一项所述的核酸构建体,其中每个构建体编码不同的异源多肽。38.一种细胞群体,所述细胞群体包含权利要求37所述的文库。39.一种细胞,所述细胞包含一种或多种权利要求21
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36中任一项所述的核酸构建体。40.如权利要求39所述的细胞,其中所述细胞是人T细胞。41.一种用于确定具有特定DNA模板的细胞的转录组的方法,所述方法包括:(a)向细胞群体中引入:(i)切割所述细胞的基因组中的靶区域以产生靶插入位点的靶向核酸酶;和(ii)序列彼此不同的多个DNA模板,其中每个DNA模板包含:i.异源编码或非编码核酸序列;ii.指示所述异源编码或非编码核酸序列的身份的独特条形码核苷酸序列;和iii.共同引物结合序列,其中每个DNA模板的5
′
端和3
′
端包含与所述靶插入位点侧翼的基因组序列同源的核苷酸序列,并且其中无一个、一个或两个同源核苷酸序列与所述基因组序列中的同源序列相
比包含错配核苷酸序列,其中所述错配核苷酸序列在重组期间不插入到所述靶插入位点中;(b)允许重组发生,从而产生修饰细胞群体;(c)在所述引入、所述允许或两者之前或之后,将所述细胞分成多个分区,其中至少大多数分区含有单个细胞;(d)在所述分区中,通过延伸与所述细胞中的mRNA互补的寡核苷酸来从所述mRNA生成cDNA,其中所述寡核苷酸包含分区特异性条形码,从而形成与分区特异性条形码连接的cDNA的池;(e)组合所述分区的内含物以形成来自多个细胞的cDNA混合物;(f)从所述cDNA混合物的第一等分试样,至少扩增所述cDNA的包含所述独特条形码和所述分区特异性条形码的双条形码部分;(g)对所述双条形码部分进行核苷酸测序以生成包含所述独特条形码和所述分区特异性条形码的测序读段;(h)从所述cDNA池的所述第一等分试样或第二等分试样,进行对所述池中的cDNA的核苷酸测序,从而生成包含分区特异性条形码和来自多个cDNA的序列的测序读段,(i)基于所述双条形码部分测序读段将独特条形码序列与分区特异性条形码序列相关联,从而形成特定DNA模板与分区特异性条形码的关联;以及(j)使用(i)的所述关联将来自所述第二等分试样的测序读段与特定模板相关联,从而提供具有特定DNA模板的细胞的转录组。42.如权利要求41所述的方法,所述方法还包括确定所述群体中具有插入所述靶插入位点中的不同DNA模板的细胞的相对数量。43.如权利要求41
‑
42中任一项所述的方法,所述方法还包括向所述修饰细胞群体施加选择压力。44.如权利要求43中任一项所述的方法,所述方法还包括比较在对所述细胞施加选择压力之前和之后所述群体中具有插入所述靶插入位点中的不同DNA模板的细胞的相对数量。45.如权利要求41
‑
44中任一项所述的方法,其中通过将包含所述DNA模板的病毒载体引入所述细胞中来插入所述DNA模板。46.如权利要求41
‑
45中任一项所述的方法,其中所述群体是哺乳动物细胞群体。47.如权利要求46所述的方法,其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。48.如权利要求47所述的方法,其中所述人类细胞是T细胞。49.如权利要求48所述的方法,其中所述T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或原初T细胞。50.如权利要求49所述的方法,其中所述效应T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。51.如权利要求49所述的方法,其中所述效应T细胞是CD8+CD4+T细胞。52.如权利要求41
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51中任一项所述的方法,其中所述细胞是原代细胞。53.如权利要求41
‑
52中任一项所述的方法,其中所述DNA模板包含编码异源多肽的核酸。54.如权利要求41
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53任一项所述的方法,其中所述靶插入位点在TCR
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α亚基恒定基因
(TRAC)的外显子1或TCR
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β亚基恒定基因(TRBC)的外显子1中。55.如权利要求54所述的方法,其中所述基因组序列是人T细胞TCR基因座序列。56.如权利要求41
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55中任一项所述的方法,其中所述靶向核酸酶选自由以下组成的组:RNA指导的核酸酶结构域、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。57.如权利要求56所述的方法,其中将所述靶向核酸酶、指导RNA和所述DNA模板作为核糖核蛋白复合物(RNP)
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DNA模板复合物引入所述细胞中,其中所述RNP
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DNA模板复合物包含:(i)所述RNP,其中所述RNP包含所述靶向核酸酶和所述指导RNA;和(ii)所述DNA模板。58.一种人T细胞,所述人T细胞异源表达选自由以下组成的组的多肽:包含人PD
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1胞外结构域和跨膜结构域并且缺少80
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90个(例如87个)羧基末端PD
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1氨基酸的截短的人PD
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1蛋白;包含经由跨膜结构域连接至人4
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1BB胞内结构域的人PD
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1胞外结构域或其至少120或130个氨基酸的部分(和任选地4
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1BB胞外结构域的1
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20个(例如11个)氨基酸)的多肽;包含经由跨膜结构域连接至人MyD88胞内结构域或其至少90或100个氨基酸的部分(和任选地PD
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1胞内结构域的1
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10个氨基酸)的人PD
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1胞外结构域的多肽;包含经由跨膜结构域连接至人ICOS胞内结构域的人PD
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1胞外结构域的多肽;包含人CTLA4胞外结构域和跨膜结构域并且缺少30
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40个(例如34个)羧基末端CTLA4氨基酸的截短的人CTLA4蛋白;包含经由跨膜结构域连接至人CD28胞内结构域或其至少30或40个氨基酸的部分(和任选地CTLA4胞内结构域的1
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10个氨基酸)的人CTLA4胞外结构域的多肽;包含人CD200R胞外结构域和跨膜结构域并且缺少50
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60个羧基末端CD200R氨基酸的截短的人CD200R蛋白;包含人BTLA胞外结构域和跨膜结构域并且缺少100
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110个(例如104个)羧基末端BTLA氨基酸的截短的人BTLA蛋白。在一些实施方案中,所述截短的人BTLA蛋白包含所述人BTLA胞内结构域的前1
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12个(例如6个)氨基酸但缺少剩余的人BTLA蛋白胞内结构域;包含经由跨膜结构域连接至人CD28胞内结构域的人BTLA胞外结构域或其至少1...
【专利技术属性】
技术研发人员:T,
申请(专利权)人:加利福尼亚大学董事会,
类型:发明
国别省市:
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