一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法技术

本发明专利技术提供一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，将含有血清1型鸭甲型肝炎和血清3型鸭甲型肝炎的混合抗原接种7~9日龄SPF鸡胚，24小时内死亡鸡胚弃去，收集接种后24~120小时所有的鸡胚组织，进行总RNA提取，分别利用DHAV

【技术实现步骤摘要】
提取，利用DHAV
‑
1特异性引物和DHAV
‑
3特异性引物分别对7～9日龄接种组鸡胚组织进行 RT
‑
PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后，统计两种病毒PCR阳性数，即该病毒对鸡胚的感染阳性数量，计算两种抗原的鸡胚半数感染量(EID
50
)。
[0013]本专利技术还提供一种血清1型鸭甲型肝炎弱毒株(A66株，Duck hepatitis virus)，保藏编号为：CGMCC No.8020。
[0014]本专利技术还提供一种血清3型鸭甲型肝炎弱毒株(HuB60株，Duck hepatitis A virus)，保藏编号为：CGMCC No.10307。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016](1)本专利技术通过RT
‑
PCR方法分别确定两种病毒对鸡胚的感染阳性数及半数感染量，能够完全确定和区分两种抗原，不需要事先进行血清中和处理，且二者之间不存在交叉反应，与空白鸡胚组织和其他病毒亦不产生非特异性扩增；
[0017](2)本专利技术利用相对简单的技术手段实现了良好的技术效果，从根本上解决了血清交叉中和不确定、不准确以及动物试验检验不安全等问题，对于血清1型、血清3型鸭甲型肝炎二价弱毒活疫苗的研发而言，突破了其成品疫苗检验的技术瓶颈，具有重要的利用价值和推广前景。
具体实施方式：
[0018]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
[0020]S1、取待检二价活疫苗进行10倍系列稀释，取相应稀释度，将每个稀释度的待检二价活疫苗接种7～9日龄SPF鸡胚各5枚，所述二价活疫苗同时含有血清1型鸭甲型肝炎弱病毒(如 A66株)和血清3型鸭甲型肝炎弱病毒(如HuB60株)；
[0021]S2、逐日照胚，将接种后24h内死亡的鸡胚弃去，将接种后24h～120h死亡的鸡胚置4℃冰箱暂存，至120h后取出所有鸡胚，收集接种后24h～120h所有鸡胚胚体；
[0022]S3、将S2中收集的接种后24h～120h内所有鸡胚胚体，通过总RNA提取，利用DHAV
‑
1 特异性引物和DHAV
‑
3特异性引物分别对7～9日龄接种组鸡胚组织进行RT
‑
PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后，统计两种病毒PCR阳性数，即该病毒对鸡胚的感染阳性数量，计算两种抗原的鸡胚半数感染量(EID
50
)。
[0023]本专利技术还提供一种血清1型鸭甲型肝炎弱毒株(A66株，Duck hepatitis virus)，保藏编号为：CGMCC No.8020。
[0024]同时本专利技术还提供了一种血清3型鸭甲型肝炎弱毒株(HuB60株，Duckhepatitis A virus)，保藏编号为：CGMCC No.10307。
[0025]本专利技术所涉及的两株弱毒株，血清1型鸭甲型肝炎病毒弱毒(A66株)和血清3型鸭甲型肝炎病毒弱毒(HuB60株)均由本专利技术人所在实验室自行研发，均适用于接种7～9日龄SPF 鸡胚增殖。
[0026]本专利技术将混合抗原或者疫苗10倍系列稀释之后，取相应的稀释度，每个稀释度接
种7～9 日龄SPF鸡胚各5枚，弃去24h内死亡鸡胚，收集培养120h所有鸡胚。另外，由于鸭甲型肝炎病毒致死的鸡胚，以胚体组织病毒含量最高，故PCR检测选择鸡胚组织进行测定。
[0027]实施例
[0028]以下结合实施例对本专利技术鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法进行详细说明。
[0029]一、抗原的制备与冻干
[0030]1、血清1型鸭甲型肝炎病毒A66株抗原的制备：
[0031]取DHAV
‑
1A66株种毒鸭肝炎病毒Duck hepatitis virus，该毒株已于2013年08月13 日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020)，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，接种7～9日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经匀浆，留样后冻存(共收获抗原量350ml)。对留样进行无菌检验。
[0032]2、血清3型鸭甲型肝炎病毒HuB60株抗原的制备：
[0033]取DHAV
‑
3HuB60株种毒鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，该毒株已于2015年01 月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.10307)，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，接种7～9日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经匀浆、过滤、留样后冻存(共收获抗原量300ml)。对留样进行无菌检验。
[0034]3、冻干
[0035]取无菌检验合格的抗原DHAV
‑
1A66株200ml，分装，4ml/瓶；取无菌检验合格的抗原 DHAV
‑
3HUB60株150ml，分装，4ml/瓶；将剩余的抗原(DHAV
‑
1A66株150ml、DHAV
‑
3HuB60 株150ml)充分混合，分装，4ml/瓶。将三组分装后的抗原，进行真空冷冻干燥。抗原制备总量和冻干出箱数见表1。
[0036]表1抗原制备总量和冻干出箱数
[0037] 抗原总量(ml)分装瓶数(瓶)冻干出箱数(瓶)DHAV
‑
1(A66株)2004341DHAV
‑
3(HuB60株)1503430混合(A66株+HuB60株)3006863
[0038]二、疫苗效力测定。
[0039]1、血清1型鸭甲型肝炎病毒A66株冻干样品病毒含量测定
[0040]将血清1型鸭甲型肝炎病毒A66株冻干样品，用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10
‑3、 10
‑4、10
‑5、10
‑
6 4个稀释度，每个稀释度分别接种8日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，接种后24小时内死亡的鸡胚弃去不计，统计24～120小时死亡的鸡胚，计算ELD
50
。
[0041]2、血清3型鸭甲型肝炎病毒HuB60株冻干样品病毒含量测定
[0042]将血清3型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取待检二价活疫苗，接种7~9日龄鸡胚，所述二价活疫苗同时含有血清1型鸭甲型肝炎弱病毒A66株和血清3型鸭甲型肝炎弱病毒HuB60株；S2、弃去接种后24h内死亡的鸡胚，收集接种后24h~120h所有鸡胚胚体；S3、将S2中收集的鸡胚胚体进行总RNA提取，利用RT
‑
PCR方法分别确定两种病毒对鸡胚的感染阳性数量，判定其半数感染量EID
50
。2.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，其特征在于，S1具体为：取待检二价活疫苗进行10倍系列稀释，取相应稀释度，将每个稀释度的待检二价活疫苗分别通过接种7~9日龄SPF鸡胚。3.根据权利要求1所述的鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，其特征在于，S2具体为：逐日照胚，将接种后2...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢凤英，张小飞，吴凤瑶，赵莎，刘青涛，沈丽雅，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：