本发明专利技术公开了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，属于猕猴桃脱毒技术领域。所述的小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：取感染病毒的猕猴桃外植体、切取茎尖、预培养、小滴玻璃化处理并投入液氮、解冻、恢复培养、植株再生和继代培养。本发明专利技术小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。具有较好的技术效果和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法
[0001]本专利技术属于植物病毒学
，特别是涉及猕猴桃病毒的脱除方法。
技术介绍
[0002]猕猴桃属于猕猴桃科(Actinidiaceae)，猕猴桃属(Actinidia)，中国是猕猴桃的起源与分布中心。猕猴桃的营养价值高，其果实和根部广泛应用于食品和医疗领域，栽培地遍布世界各地。近年来，中国的猕猴桃产业发展迅速，在猕猴桃种植面积和产量上都有着极大的提升。陕西省作为中国猕猴桃的主要生产省份，为中国和世界猕猴桃产量作出了巨大的贡献，分别占中国猕猴桃总产量的60％和世界猕猴桃总产量的40％。近年来，随着猕猴桃种植面积的不断扩大以及猕猴桃的大范围连片种植，造成猕猴桃易于发生多种病害。猕猴桃是多年生果树，一旦被病毒侵染便会终生带毒，并且会通过不同的途径向周围的植株传播病毒。多年来，人们常常关注溃疡病对猕猴桃的危害，确忽略了病毒病对猕猴桃的潜在危害，造成田间大量猕猴桃植株被多种病毒混合侵染，严重影响了猕猴桃的产量和品质。
[0003]猕猴桃一旦被病毒感染便会终生带毒，没有较好的治疗方法，推广使用脱毒苗是解决猕猴桃病毒危害最经济有效的方法。然而，目前没有关于猕猴桃脱毒方法的报道，市场上也缺乏猕猴桃脱毒苗。
技术实现思路
[0004]本研究针对我国猕猴桃病毒病害发生的现状，专利技术了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法。
[0005]本专利技术可通过如下技术方案实现：一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：
[0006]剥离2mm左右的猕猴桃茎尖在继代培养基上培养1天后转入含有甘油和蔗糖的液体培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液体蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s-1
m-2
弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生。
[0007]所述的继代培养基成为：MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH5.8。
[0008]所述的含有甘油和蔗糖的培养基配方为：MS+2.0M甘油+0.8M蔗糖。
[0009]所述的液体蔗糖培养基配方为：MS+1.2M蔗糖。
[0010]本专利技术小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法具有操作简单、耗时短、脱毒率高、再生率高的优点，具有较好的技术效果和应用前景。
附图说明
[0011]图1是4种病毒的RT-PCR检测结果：A-D分别为猕猴桃病毒2(AcV2)、猕猴桃黄化病毒1(AcYV1)、猕猴桃黄化病毒2(AcYV2)和猕猴桃黄化环斑病毒(AYRSpV)的检测结果；M：DNA分子量标准；1-10分别为10个茎尖超低温脱毒后再生的猕猴桃苗；其中对于AcV2，2-5、9和10号样品均脱除了该病毒；对于AcYV1，1-5和8-10号样品均脱除了该病毒；对于AcYV2，2-6、9和10号样品均脱除了该病毒；对于AYRSpV，1、2、5、6和8-10号样品均脱除了该病毒。
[0012]图2是经过茎尖超低温脱毒后再生的徐香猕猴桃组培苗。
具体实施方式
[0013]为了理解本专利技术，下面以实施例进一步说明本专利技术，但下述实施例并不限制本专利技术。
[0014]本专利技术提供了一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，具体包括以下步骤：剥离2mm左右的猕猴桃茎尖50个，在继代培养基(MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH5.8)上培养1天后转入MS+2.0M甘油+0.8M蔗糖培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液MS+1.2M蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s-1
m-2
弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培养基中在正常光照下进行再生。再生一周后统计成活幼苗数，计算成活率。结果50个茎尖最终成活34个，成活率为68％。
[0015]对成活的幼苗继续进行光照培养，3周后需要继代培养一次，继代后再培养4周，进行AcV2、AcYV1、AcYV2和AYRSpV4种猕候桃病毒的RT-PCR检测。检测引物由北京奥科生物科技有限公司合成，具体引物名称和序列见表1。
[0016]表1 4中猕猴桃病毒的检测引物
[0017][0018]具体检测步骤包括样品总RNA的提取，RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测。检测后统计以上4种病毒的脱毒率，结果AcV2的脱毒率为67.6％，AcYV1的脱毒率为76.5％，AcYV2的脱毒率为73.5％，AYRSpV的脱毒率为64.7％。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种小滴玻璃化法猕猴桃茎尖超低温脱毒的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：剥离2mm左右的猕猴桃茎尖在继代培养基上培养1天后转入含有甘油和蔗糖的液体培养基上再培养1天，将茎尖转入PVS2中在冰上处理40分钟后转到灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻处理1h，再将铝箔条快速取出并浸入液体蔗糖培养基中进行解冻。解冻20min后取出茎尖，用滤纸吸干表面的水分，移入继代培养基中进行再生培养，前3天黑暗处理，第4天开始10μmol s-1
m-2
弱光培养，再生一周后茎尖转入新的继代培...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵磊，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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