编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用，编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因，运用贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因制备壳聚糖酶，壳聚糖酶表达后为胞外酶，因此，诱导表达后不需要细胞破碎，直接收集上清液即为壳聚糖酶。接收集上清液即为壳聚糖酶。接收集上清液即为壳聚糖酶。

【技术实现步骤摘要】
编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别地，涉及一种编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因。此外，本专利技术还涉及一种包括壳聚糖酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]壳聚糖(chitosan)是由甲壳素脱除部分N
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脱乙酰基的产物，具有生物降解性、促进作物生长、提高作物抗逆性、无残留等多种生物特性，广泛应用于农业领域。但是壳聚糖分子量大，水溶性差，不易被植物吸收；同时其具有极强的絮凝作用，严重限制了壳聚糖与其他制剂的复配使用，进一步限制了其大规模应用。为解决以上不足，通过降解壳聚糖进一步获得的壳寡糖，聚合度通常在20以下，极大的改善了水溶性，使其极易被植物吸收性，具有壳聚糖无可比拟的优越性。
[0003]壳聚糖通过化学法、物理法、生物酶法降解生产壳寡糖，运用壳聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.1.132)水解壳聚糖制备壳寡糖的生物酶法具有能耗低、专一性强、反应条件温和、环境污染小等特征。目前已有多种来自真菌、细菌、植物等生物的壳聚糖酶被研究报道。但是有关于运用贝莱斯芽孢杆菌制备壳聚糖酶却鲜有报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因，以解决现有壳聚糖，聚合度大，水溶性差，无法大规模推广应用的技术问题。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/>[0007]根据壳聚糖酶基因(NCBI登录号：OK149223)的保守序列设计通用引物。通用引物包括正向引物Csn(90)
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F和反向引物Csn(670)
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R。正向引物Csn(90)
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物序列为Csn(90)
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F：CATGTGTTTTACCCTGATGATGA，反向引物Csn(670)
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物序列Csn(670)
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R：GATTCATCAGATCGTCATAGCG。CTAB法提取贝莱斯芽孢杆菌CS1(来自于本单位分离保存)的基因组DNA。使用保守序列引物(Csn(90)
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F/Csn(670)
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R)以基因组DNA为模板，扩增目的基因的部分片段。
[0008]PCR扩增产物纯化回收后连接T载体测序，序列在NCBI中BLAST比对，获得包含同源序列的贝莱斯芽孢杆菌基因组序列。随后以该基因组序列为参考，设计扩增壳聚糖酶基因ORF片段的带有EcoRⅠ和Xhol
ꢀⅠ
酶切位点的引物，引物包括正向引物Csn_ORF_F和反向引物Csn_ORF_R；正向引物Csn_ORF_F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物序列为Csn_ORF_F：CCGAATTCATGAAAATCAGCTTGAAGAA；反向引物Csn_ORF_R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，引物序列为Csn_ORF_R：TGCTCGAGTTGAATAGTGAAATTACCGTAT。再以基因组DNA为模板，高保真PCR扩增带有酶切位点的完整的编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过分析，上述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶为胞外酶，因此，诱导表达后不需要细胞破碎，直接收集上清液即为壳聚糖酶。
[0010]如图1所示，上述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的属于糖苷水解酶GH46家族，其分子量为31.352KD，酶活性(效价)为185U/mL。贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的表达量为2.5mg/mL。
[0011]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种重组质粒，包括上述编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因。
[0012]优选地，重组质粒的载体采用pET28a。通过采用pET28a表达质粒构建一个包括上述壳聚糖酶基因序列的重组质粒，并将重组质粒通过热击转化到大肠杆菌BL21(ED3)中，制备表达该基因的原核重组表达菌株。
[0013]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种重组表达菌株，包括上述重组质粒。
[0014]将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(ED3)在LB培养基中培养、IPTG诱导表达，离心，分别收集上清和菌体。SDS
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PAGE胶蛋白质电泳分析，表达壳聚糖酶主要分布于上清液中，因此为胞外酶，收集上清即获得具有壳聚糖酶活性的粗酶溶液，也即壳聚糖酶。BCA蛋白定量法检测上清中壳聚糖酶含量为2.5mg/mL。
[0015]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种根据上述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：
[0016]将上述基因重组至pET28a载体中，再转化到大肠杆菌中，构建重组表达菌株；
[0017]将重组表达菌株培养，并在IPTG诱导表达，离心，收集上清液，获得壳聚糖酶。
[0018]上述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的制备方法，通过分析上述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶为胞外酶，因此对重组表达菌株诱导表达后不需要细胞破碎，直接收集上清液，即获得壳聚糖酶。
[0019]优选地，扩增基因的引物包括正向引物Csn_ORF_F和反向引物Csn_ORF_R；正向引物Csn_ORF_F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，反向引物Csn_ORF_R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0020]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种上述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶在酶解壳聚糖中的应用，将壳聚糖酶加入到壳聚糖溶液中进行酶解反应，获得壳寡糖。壳聚糖酶对壳聚糖(95％脱乙酰度)的水解效率最高达到95％；酶解反应的反应温度为30℃～50℃，反应pH值为5～6.5，反应时间为5h～10h。壳寡糖的聚合度为2～5。
[0021]将上述酶活为9.0U的壳聚糖酶与1g/L～5g/L的壳聚糖(95％脱乙酰度)溶液直接混合，反应温度为30℃～50℃，反应pH值为5～6.5，反应时间为5h～10h的条件下进行酶解，壳聚糖酶对壳聚糖(95％脱乙酰度)的水解效率最高达到95％。最终获得的壳寡糖的聚合度为2～5，显著低于壳聚糖的聚合度，壳寡糖的分子量小，极大的改善了水溶性，易于被植物吸收，扩大了壳寡糖的应用。优选地，酶解反应的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为5.5。
[0022]根据本专利技术的另一方面，还提供了一种上述壳寡糖在辣椒促生长中的应用，配置壳寡糖溶液，将壳寡糖溶液喷施在辣椒幼苗时期。壳寡糖溶液的浓度为0.002g/L～1g/L。将壳寡糖溶液直接喷施在辣椒幼苗上，辣椒幼苗具有3～5片真叶，移栽10天后喷施第一次，此
后每间隔10天喷施一次，总共喷施3次，第三次喷施后第15天统计鲜重和花本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的属于糖苷水解酶GH46家族，其分子量为31.352KD，酶活性(效价)为185U/mL；和/或所述贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的表达量为2.5mg/mL。4.一种重组质粒，其特征在于，包括权利要求1所述的编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体采用pET28a。6.一种重组表达菌株，其特征在于，包括权利要求4或5所述的重组质粒。7.一种根据权利要求2或3所述的贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，将权利要求1的基因重组至pET28a载体中，再转化到大肠杆菌中，构建重组表达菌株；将重组表达菌株培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：王忠勇，刘勇，张德咏，程菊娥，张宇，吴希阳，乐昊，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：