等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用制造技术

本申请涉及分子生物学检测技术领域，提供了一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用。本申请提供的等温扩增检测克氏锥虫的试剂包括用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5以及第二环引物SEQ ID No.6，该环介导等温核酸扩增引物组特异性强，能够有效区分疟原虫属中的其它疟原虫种，使得本申请试剂用于检测克氏锥虫具有灵敏度高、重复性好、假阴性以及假阳性低，检测准确率高，还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断。颜色变化而直接进行结果判断。颜色变化而直接进行结果判断。

【技术实现步骤摘要】
等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用


[0001]本申请属于分子生物学检测
，尤其涉及一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]美洲锥虫病又称为恰加斯病(Chagas disease)，由克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)引起，传播媒介是锥蝽。该病主要发生在21个拉丁美洲国家，多见于儿童，急性期表现为发热、全身性淋巴结肿大和心脏扩大。慢性期则以心肌炎、心脏扩大、食道或结肠扩张为主要特征。2017年，全世界估计有620万人患有恰加斯病，每年约有162,000例新感染和7900例死亡。这导致全球每年的经济负担估计为72亿美元。
[0003]我国虽然不是美洲锥虫病流行区，但部分地区有锥蝽分布，一旦美洲锥虫病输入我国，有可能造成局部传播。随着我国国际交往、劳务输出和跨境旅游人数的增长，锥虫病的输入性风险也随之不断增加，迫切需要我国政府对该病引起高度重视，加强对美洲锥虫病的检测和监测研究。
[0004]目前，多种不同的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)测试可用于检测克氏锥虫DNA，这种特定方法虽然可以在寄生虫含量很低的情况下检测出克氏锥虫，然而PCR需要荧光染料，其检测需要专业人员操作和专业的昂贵仪器。另外，现有提取待测样品核酸需要移液器、枪头、离心机、恒温金属浴和PCR仪等昂贵且不便于携带的仪器，并且提取需要专业人士进行专业操作。
[0005]因此，现有的待测样品核酸提取和PCR存在需要专业人员操作、成本高以及检测不方便的问题。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供一种检测等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒以及其应用，旨在解决现有技术中的待测样品核酸提取和荧光PCR检测存在需要专业人员操作、成本高以及检测不方便的问题。
[0007]为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本申请提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，所述试剂包括如下用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组：
[0009]第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。
[0010]第二方面，本申请提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒，所述等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒包括本申请的等温扩增检测克氏锥虫的试剂。
[0011]第三方面，本申请提供一种检测克氏锥虫的方法，所述检测克氏锥虫的方法包括如下步骤：
[0012]获取待检测样品核酸；
[0013]将所述待测样本核酸与本申请的所述试剂或本申请的所述试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；
[0014]根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。
[0015]本申请第一方面提供的等温扩增检测克氏锥虫的试剂所含的环介导等温核酸扩增引物组特异性强，能够有效区分疟原虫属中的其它疟原虫种，使得本申请试剂用于检测克氏锥虫具有灵敏度高、重复性好、假阴性以及假阳性低，检测准确率高。同时，本申请提供的环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，从而可以简易快速检测克氏锥虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
[0016]本申请第二方面提供的等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒，由于所述试剂盒包括本申请的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，因此，所述试剂盒用于检测克氏锥虫具有灵敏度高、重复性好、假阴性以及假阳性低，检测准确率高；同时，该环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，使得所述试剂能够简易快速检测克氏锥虫；并且当所述试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用所述试剂盒检测克氏锥虫时不用依赖专业人员及专业仪器，使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
[0017]本申请第三方面提供的检测克氏锥虫的方法，其通过获取待检测样品核酸，并将所述待测样本核酸与本申请的所述试剂或所述试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理，再根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。本申请检测克氏锥虫的方法由于是利用本申请试剂盒进行检测，因此，所述检测克氏锥虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高，并且可以直接通过裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，因此，所述检测克氏锥虫的方法不需要依赖专业人员及专业仪器，使得本申请检测克氏锥虫的方法拥有更宽的发挥场景及更好的临场检测能力。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1是本申请实施例提供的克氏锥虫阳性质控品(浓度为1000copies/μL)扩增结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果显色照片，1
‑
4号孔为克氏锥虫阳性质控品扩增体系最终颜色为黄绿色；5号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色；
[0020]图2是本申请实施例提供的克氏锥虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度的LAMP扩增结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果显色照片。1号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；2号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；3号孔为10拷贝/μL浓度
的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；4号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色；
[0021]图3是本申请实施例提供的克氏锥虫的LAMP引物扩增“克氏锥虫核酸DNA”的结果显色照片，1号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色；
[0022]图4是本申请实施例提供的克氏锥虫的LAMP引物扩增“无核酸酶水”的结果显色照片；1号为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；
[0023]图5是本申请实施例提供的克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增“含布氏冈比亚锥虫锥虫基因的质粒DNA(10000拷贝/μL)和含布氏罗德西亚锥虫锥虫基因的质粒DNA”的结果显色照片，1和2号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。
具体实施方式
[0024]为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述试剂包括如下用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。2.如权利要求1所述的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2的使用浓度相同或不相同的为1.0
‑
2.5μM；和/或所述第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4的使用浓度相同或不相同为45
‑
70μM；和/或所述第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6的使用浓度相同或不相同为10
‑
30μM。3.如权利要求1或2所述的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述试剂还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。4.如权利要求3所述的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述聚合酶为Bst聚合酶；和/或所述pH染料为间甲酚紫；和/或所述等温扩增缓冲液包括KCL...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈木新，张仁利，艾琳，黄达娜，张岩，陈燕旌，刘琴，唐屹君，边素莹，林梓丹，邓少玉，张倩，陈家旭，苏川，周晓农，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家热带病研究中心，
类型：发明
国别省市：