一种庚二酸的全生物合成方法技术

本发明专利技术公开了一种庚二酸的全生物合成方法，属于生物工程领域。本发明专利技术是以敲除了乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙酰

【技术实现步骤摘要】
一种庚二酸的全生物合成方法


[0001]本专利技术涉及一种庚二酸的全生物合成方法，属于生物工程领域。

技术介绍

[0002]庚二酸(Pimelic acid，Heptanedioic acid)，又名蒲桃酸，1,5－戊烷二羧酸，是一种七碳二元羧酸，广泛用于合成润滑油、增塑剂、共聚物、表面活性剂等，是化工行业中重要的化学原料和中间体。
[0003]目前工业上生产庚二酸主要依赖于化学方法。通过异戊醇还原，并用钠裂解水杨酸，结晶出庚二酸，收率为43
‑
50％。庚二酸的实验室制备方法还包括以冠醚作为相转移催化剂催化1,5
‑
戊二醇、三溴化磷、氰化钾合成庚二酸。这些方法工艺繁多，反应时间长，不利于大规模推广。
[0004]为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成庚二酸的道路上。目前报道的庚二酸的生物合成途径主要有两种途径：一种是大肠杆菌体内的BioC
‑
BioH途径，BioC(转甲基酶)可甲基化丙二酰
‑
酰基载体蛋白(ACP)生成丙二酰甲酯，降低分子极性，从而允许脂肪酸合成酶对后者进行延伸，生成庚二酸衍生物——庚二酰
‑
ACP甲酯；BioH可以水解庚二酰ACP甲酯的末端甲基，恢复极性羧基，阻止脂肪酸合成酶进一步延伸，进而产生庚二酸。另一种则是枯草芽孢杆菌的BioI
‑
BioW途径，有研究指出枯草芽孢杆菌生物素操纵子中bioI
‑
orf2
‑
orf3基因序列与庚二酸的合成密切相关，将强麦芽糖启动子P
glv
连接到bioI
‑
orf2
‑
orf3顺反子上游，整合到枯草芽孢杆菌染色体上，最终可以有效增加庚二酸的产量。上述的两种途径都产生了微量的庚二酸，但对于其合成机理并未进一步阐明。
[0005]自然界中存在着天然的二元羧酸合成/分解代谢途径，其中褐色喜热裂孢菌的3
‑
氧代己二酰辅酶A途径可以高效的利用己二酸，在大肠杆菌中重构该途径，可以利用乙酰
‑
CoA和琥珀酰
‑
CoA为底物使己二酸的产量达到68.0g
·
L
‑1(目前报导的最高值)。同样地，该途径还可利用乙酰
‑
CoA和丙二酰
‑
CoA合成戊二酸，产量达到4.8g
·
L
‑1。究其原因，该途径中的β
‑
酮硫解酶(Tfu_0875)底物谱较宽，可同时催化多种酰基
‑
CoA生成不同的二元羧酸。因此，利用代谢网络极强的可塑性，通过天然代谢途径和合成途径的结合，我们可以以己二酸逆降解途径为基础，设计以低廉、可再生的原料(葡萄糖等)到庚二酸的生物合成新路线，为庚二酸在微生物体内的合成提供新思路。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术提供了一种产庚二酸的重组大肠杆菌，分模块过量表达了来自褐色喜热裂孢菌的β
‑
酮硫解酶(Tfu_0875)、3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶(Tfu_2399)、3
‑
羟基己二酰脱氢酶(Tfu_0067)、5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶(Tfu_1647)和己二酰辅酶A合成酶的基因(Tfu_2576，Tfu_2577)，并敲除了基因ldhA、atoB、sucD，实现了将戊二酸高效转化为庚二酸，显著提升了庚二酸的产量。
[0007]本专利技术提供了一种全细胞生产庚二酸的方法，所述方法是利用基因工程菌发酵生
产庚二酸；所述基因工程菌敲除了乳酸脱氢酶基因、乙酰
‑
CoA乙酰基转移酶基因及琥珀酰
‑
CoA合成酶α亚基基因，并分模块过表达编码来自褐色喜热裂孢菌的β
‑
酮硫解酶(Tfu_0875)、3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶(Tfu_2399)、3
‑
羟基己二酰脱氢酶(Tfu_0067)、5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶(Tfu_1647)和己二酰辅酶A合成酶的基因(Tfu_2576，Tfu_2577，即Tfu_2576
‑
7)。
[0008]在一种实施方式中，所述β
‑
酮硫解酶(Tfu_0875)的NCBI登录号为MH157180；所述3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶(Tfu_2399)的NCBI登录号为MH157181；所述3
‑
羟基己二酰脱氢酶(Tfu_0067)的NCBI登录号为MH157182；所述5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶(Tfu_1647)的NCBI登录号为MH157183；所述己二酰辅酶A合成酶的基因(Tfu_2576，Tfu_2577，即Tfu_2576
‑
7)的NCBI登录号为MH157194。
[0009]在一种实施方式中，利用质粒pRSFDuet
‑
1表达所述β
‑
酮硫解酶和3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶。
[0010]在一种实施方式中，利用质粒pTrc99a表达所述3
‑
羟基己二酰脱氢酶和5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶。
[0011]在一种实施方式中，利用质粒pCDFDuet
‑
1表达所述己二酰辅酶A合成酶。
[0012]在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。
[0013]在一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
[0014]在一种实施方式中，将所述基因工程菌在35～37℃培养12
‑
16小时得到菌液，将菌液按1～5％的体积比接种至至发酵培养基，于35～37℃培养至OD
600
为0.6
‑
0.8时加入终浓度为1～5mM的IPTG并降温至25～30℃诱导培养72小时。
[0015]在一种实施方式中，发酵培养基为SOB培养基，所述SOB培养基中含有3～5g
·
L
‑1酵母粉，15～20g
·
L
‑1胰蛋白胨，1～5g
·
L
‑1NaCl，2～3g
·
L
‑1MgCl2·
6H2O，0.1～0.2g
·
L
‑1KCl，1～4g
·
L
‑1葡萄糖，10～50μg
·
mL
‑1硫酸卡那霉素，10～50μg
·
mL
‑1氨苄青霉素，10～50μg
·
mL...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全细胞生产庚二酸的方法，其特征在于，利用基因工程菌发酵生产庚二酸；所述基因工程菌敲除了乳酸脱氢酶基因、乙酰
‑
CoA乙酰基转移酶基因及琥珀酰
‑
CoA合成酶α亚基基因，并分模块过表达编码来自褐色喜热裂孢菌的β
‑
酮硫解酶、3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶、3
‑
羟基己二酰脱氢酶、5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶和己二酰辅酶A合成酶的基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用质粒pRSFDuet
‑
1表达所述β
‑
酮硫解酶和3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用质粒pTrc99a表达所述3
‑
羟基己二酰脱氢酶和5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用质粒pCDFDuet
‑
1表达所述己二酰辅酶A合成酶。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述β
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，李国辉，鲍青青，支睿，李顺，毛银，赵运英，周胜虎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：