一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用。本发明专利技术提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、egfp阅读框、2A肽的编码序列和多位点人工接头序列。与现有技术相比，本发明专利技术中的载体含有大豆内源启动子驱动的GFP

【技术实现步骤摘要】
一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]反向遗传学是研究基因表型的重要方法之一，将目的基因进行过量的表达，能够鉴定基因的表型。常见的反向遗传学手段是转基因，获得大豆的T1代转基因植株需要5到8个月的时间，实验周期很长。根中基因的表达差异会影响根系发育和抗性，在根系生物学的研究中，研究学者们往往只关注根部的表型，而非整株。探索快速且特异性产生转基因大豆根的方法，能缩减实验周期。
[0003]有研究指出，发根农杆菌K599可以诱导大豆产生毛状根，此后的研究证实，将质粒导入K599后，可以诱导高于正常表达水平的目的基因的毛状根再生。但是由于毛状根和正常的不定根形态高度相似，如何区分转基因根和大豆的不定根，成为新的难题。在转基因植株的实验中，可以使用抗除草剂基因筛选转基因植株，但因Basta等除草剂会经蒸腾作用在植物体内传导，从而对地上部分植株具有致死性，因此不适用于毛状根筛选。
[0004]利用绿色荧光蛋白(GFP)是解决此问题的一种思路。GFP结构稳定，在植物中表达可以观测到绿色荧光。在细胞生物学、发育生物学和神经科学的研究中荧光蛋白得到了广泛的应用。
[0005]因此，如何同时利用荧光蛋白技术和目的基因筛选技术，仅通过观测荧光就可以挑选表达目的基因的毛状根，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种重组表达载体及其制备方法与应用，本专利技术综合使用2A肽、大豆内源启动子和荧光蛋白标签构建了重组表达载体，并获得了同时表达两个基因的大豆毛状根。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、egfp阅读框、2A肽的编码序列和多位点人工接头序列。
[0009]优选的，所述2A肽为F2A肽、T2A肽、P2A肽和E2A肽中的一种；所述多位点人工接头序列的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。
[0010]进一步优选为F2A肽，其核苷酸序列如SEQ NO：2所示。
[0011]优选的，所述启动子为Gmubi或GmubiXL。
[0012]进一步优选为Gmubi，其核苷酸序列如SEQ NO：3所示。
[0013]本专利技术还提供了一种重组表达载体，包括所述的基因表达盒和初始载体。
[0014]优选的，所述初始载体为pCAMBIA1303、pBI121或pPZP100。
[0015]进一步优选为pCAMBIA1303。
[0016]本专利技术还提供了所述重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
[0017](1)当初始载体为pCAMBIA1303时，在初始载体的CaMV poly(A)signal和NOS终止子之间插入启动子，得到Vector
‑
P；
[0018](2)在步骤(1)得到的Vector
‑
P的启动子和NOS终止子之间插入egfp阅读框，得到Vector
‑
P
‑
E；
[0019](3)在步骤(2)得到的Vector
‑
P
‑
E的egfp阅读框和NOS终止子之间插入2A肽的编码序列，得到Vector
‑
P
‑
E
‑
2A；
[0020](4)在步骤(3)得到的Vector
‑
P
‑
E
‑
2A的2A肽编码序列和NOS终止子之间插入多位点人工接头序列获得重组表达载体Vector
‑
P
‑
E
‑
2A
‑
MCS。
[0021]本专利技术还提供了所述重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
[0022](1)当初始载体为pBI121时，在初始载体的RB T
‑
DNArepeat和NOS终止子之间插入启动子，得到Vector
‑
P；
[0023](2)在步骤(1)得到的Vector
‑
P的启动子和NOS终止子之间插入egfp阅读框，得到Vector
‑
P
‑
E；
[0024](3)在步骤(2)得到的Vector
‑
P
‑
E的egfp阅读框和NOS终止子之间插入2A肽的编码序列，得到Vector
‑
P
‑
E
‑
2A；
[0025](4)在步骤(3)得到的Vector
‑
P
‑
E
‑
2A的2A肽编码序列和NOS终止子之间插入多位点人工接头序列获得重组表达载体Vector
‑
P
‑
E
‑
2A
‑
MCS。
[0026]本专利技术还提供了所述重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
[0027](1)当初始载体为pPZP100时，在初始载体的MCS中插入NOS终止子，然后在NOS终止子和LB T
‑
DNArepeat之间插入启动子，得到Vector
‑
P；
[0028](2)在步骤(1)得到的Vector
‑
P的启动子和NOS终止子之间插入egfp阅读框，得到Vector
‑
P
‑
E；
[0029](3)在步骤(2)得到的Vector
‑
P
‑
E的egfp阅读框和NOS终止子之间插入2A肽的编码序列，得到Vector
‑
P
‑
E
‑
2A；
[0030](4)在步骤(3)得到的Vector
‑
P
‑
E
‑
2A的2A肽编码序列和NOS终止子之间插入多位点人工接头序列获得重组表达载体Vector
‑
P
‑
E
‑
2A
‑
MCS。
[0031]一种宿主，转化或转染有权利要求所述的重组表达载体。
[0032]本专利技术还提供了所述的基因表达盒、所述的重组表达载体、所述的宿主在制备转基因植物中的应用。
[0033]优选的，所述植物为大豆。
[0034]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0035]1、传统的表达载体通常使用CaMV的启动子来驱动下游基因表达，有研究指出使用内源启动子能获得更高的表达效率，在大豆中内源的Gmubi启动子的表达效率相较于35S高约40倍。同时，一类18到22个氨基酸长度的可以通过“自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、egfp阅读框、2A肽的编码序列和多位点人工接头序列。2.根据权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述2A肽为F2A肽、T2A肽、P2A肽和E2A肽中的一种；所述多位点人工接头序列的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。3.根据权利要求1或2所述的基因表达盒，其特征在于，所述启动子为Gmubi或GmubiXL。4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的基因表达盒和初始载体。5.根据权利要求4所的重组表达载体，其特征在于，所述初始载体为pCAMBIA1303、pBI121或pPZP100。6.权利要求5所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)当初始载体为pCAMBIA1303时，在初始载体的CaMV poly(A)signal和NOS终止子之间插入启动子，得到Vector
‑
P；(2)在步骤(1)得到的Vector
‑
P的启动子和NOS终止子之间插入egfp阅读框，得到Vector
‑
P
‑
E；(3)在步骤(2)得到的Vector
‑
P
‑
E的egfp阅读框和NOS终止子之间插入2A肽的编码序列，得到Vector
‑
P
‑
E
‑
2A；(4)在步骤(3)得到的Vector
‑
P
‑
E
‑
2A的2A肽编码序列和NOS终止子之间插入多位点人工接头序列获得重组表达载体Vector
‑
P
‑
E
‑
2A
‑
MCS。7.权利要求5所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)当初始载体为pBI121时，在初始载体的RB T
‑
DNA repeat和NOS终止子之间插入启动子，得到Vector
‑
P；(2)在步骤(1)得到的Vector
‑
P的启动子和NOS终止子之间插入egfp阅读框，得到Ve...

【专利技术属性】
技术研发人员：段玉玺，杨若巍，范海燕，陈立杰，王惠，朱晓峰，王媛媛，玄元虎，刘晓宇，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：