一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养及传代培养方法技术

本发明专利技术公开了一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养和传代培养方法，属于动物细胞的分离培养方法技术领域。该方法将经过预处理的离体新鲜小鼠乳腺癌组织碎块进行清洗后，放入到胶原酶I溶液中进行消化处理；消化处理后加入培养后离心留取沉淀物；将所得的沉淀物转移至培养瓶内后在培养箱中进行培养，培养48h后开始首次换液；培养结束后去除未贴壁细胞即获得目标细胞；更换培养基后培养目标细胞，待目标细胞形成细胞集落后即获得可传代培养的小鼠乳腺癌细胞。本发明专利技术在保证原代细胞分离培养纯度的条件下，缩短简化了原代细胞分离培养方法。该方法将现有技术中原代分离培养早期频繁换液方式，调整为48h首次完全换液，大大缩减了换液的次数。次数。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养及传代培养方法


[0001]本专利技术属于动物细胞的分离培养方法
，具体涉及一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养和传代培养方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来，乳腺癌的发病正日渐年轻化，且并不是单纯在女性体内发病的恶性肿瘤疾病。目前，手术及放化疗是治疗乳腺癌的主要手段。
[0003]近几年来，乳腺癌治疗取得了很大进展，已有多种针对乳腺癌的治疗手段。随着治疗研究的不断深入，越来越多的相关治疗被发现能提高患者的综合治疗效果，但后期易复发转移，传统的治疗方法无法达到很好的效果。
[0004]为更加深入地研究乳腺癌的发病机理以及各种药物或治疗手段的治疗效果，动物实验是必不可少的环节。其中，构建患有乳腺癌的试验动物的患病动物模型造模是动物实验的进行的前提和基础。目前，小鼠乳腺癌细胞(4T1)原位接种是最常见的乳腺癌动物模型造模方法。利用已有肿瘤细胞，将其转移至动物脂肪垫内，人为的将动物改造成为乳腺癌肿瘤模型，极大程度的提高了乳腺癌模型的造模成功率。
[0005]患病动物模型造模的前提是获得纯度高活性大的乳腺癌细胞，那么从癌组织中分离提取、培养、传代培养出合适质量和数量的乳腺癌细胞十分重要。目前，研究较多的是对MCF细胞(即人乳腺癌细胞)的分离提取和培养。一方面，当采用小鼠等动物进行实验时，MCF细胞的适用性有可能存在一定问题；另一方面，现有的乳腺癌细胞的分离提取以及培养方法存在，早期换液频繁、细胞活力有限、原代培养时间长等问题。
[0006]另外，乳腺癌细胞提取培养过程还容易受到成纤维细胞的污染，导致细胞活力下降。

技术实现思路

[0007]为解决目前4T1细胞在提取、培养和传代培养过程中存在的换液频繁、培养时间过长以及培养出来的细胞活力有限的技术问题，本专利技术提供了一种4T1细胞的分离培养和传代培养方法，所采取的技术方案如下：
[0008]一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，该方法将经过预处理的离体新鲜小鼠乳腺癌组织碎块进行清洗后，放入到胶原酶I溶液中进行消化处理；消化处理后加入培养后离心留取沉淀物；将所得的沉淀物转移至含培养基的培养瓶内后在培养箱中进行培养，培养48h后开始首次更换全部培养基；培养结束后去除未贴壁细胞即获得目标细胞；更换培养基后培养目标细胞，待目标细胞形成细胞集落，细胞融合度达到70％后即获得可传代培养的小鼠乳腺癌细胞，分离提取结束。
[0009]优选地，该方法的步骤如下：
[0010]1)将经过预处理新鲜离体的小鼠乳腺癌组织标本切成1mm3大小的组织碎片，并利用PBS清洗两次；
[0011]2)将步骤(1)中经过清洗的组织块放入到盛有胶原酶I的EP管内，进一步粉碎成肉泥后消化3min；
[0012]3)向步骤(2)经过消化后的溶液中加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，混合均匀后，离心留取沉淀物；
[0013]4)将步骤(3)所得沉淀物转移至含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶后放在培养箱内进行培养，培养48h后开始首次换液，当培养至无悬浮组织块时培养结束，培养结束后去除未贴壁细胞，获得目标细胞；如果首次换液后继续培养至48～72小时后，培养瓶中仍有组织块则进行第二次换液，直至培养瓶中无悬浮组织块，培养结束。
[0014]5)使用配方为：89％DMEM/F12+10％FBS+1％三抗的完全培养基培养步骤(4)的目标细胞；培养3～7天当细胞集落形成，细胞融合度达到70％后，即获得可传代培养的小鼠乳腺癌细胞。
[0015]优选地，步骤(1)所述预处理是去除多余的血液、脂肪和结缔组织。
[0016]优选地，步骤(2)的胶原酶I需经过37℃的预热。
[0017]优选地，步骤(4)的培养条件是：37℃、5％CO2。
[0018]一种上述分离培养方法获得细胞的传代培养方法，该方法的步骤如下：
[0019]1)将产生集落的细胞中的培养基和组织块去除，并加入PBS进行洗涤，洗涤后弃掉PBS；
[0020]2)向弃掉PBS的细胞培养瓶内加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶均匀覆盖在全部细胞上，在37℃下消化处理0.5～1min；
[0021]3)消化结束后，加入完全培养基终止消化：
[0022]4)将步骤(3)经消化的细胞制成细胞悬液后转移至离心管内离心分离细胞，离心留取细胞沉淀；
[0023]5)向步骤(4)所得的细胞沉淀内加入完全培养基，细胞沉淀重新悬浮后，按照1:2～4的比例进行传代培养。
[0024]优选地，步骤(2)所用胰蛋白酶为37℃预热的含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶。
[0025]优选地，步骤(3)是利用显微镜观察细胞状态，当细胞开始变圆时，轻拍培养瓶底部，促使细胞脱落后加入4倍胰蛋白酶体积的完全培养基终止消化。
[0026]相对于现有技术，本专利技术获得的有益效果：
[0027]本专利技术在保证原代细胞分离培养纯度的条件下，缩短简化了原代细胞分离培养方法。该方法将现有技术中原代分离培养早期频繁换液方式，调整为48h首次完全换液，采用完全换液方法，之后每2～3天完全换液一次，保证原代小鼠乳腺癌细胞的营养支持；培养至第7～10天镜下可见大量的集落形成，根据集落细胞的长势来决定首次传代的时间，不必等到细胞融合度达到80～90％再传代，大大缩减了换液的次数和环节。同时，本专利技术的方法还缩短了原代培养时间，现有技术中原代培养时间为10～14天，本专利技术中原代培养时间约为7～10天。
[0028]通过调整胰蛋白酶消化浓度、用量、时间，最大程度地保留了细胞生长活力，通过实验验证通过本专利技术方法制备的4T1细胞其活力均明显优于市购的4T1细胞。并且本专利技术提供的原代细胞分离培养和传代培养方法具有简便、稳定性好、重复性好的优点。
附图说明
[0029]图1为4T1细胞培养至第7天时显微镜下的细胞。
[0030]图2为实施例3中利用本专利技术的方法培养完成的4T1细胞在显微镜下的情况。
[0031]图3为实施例4中4T1细胞培养至第4代时显微镜下的细胞。
[0032]图4为实施例5中4T1细胞培养至第4代时显微镜下的细胞。
[0033]图5为实施例6中4T1细胞培养至第4代时显微镜下的细胞。
具体实施方式
[0034]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。
[0035]以下实施例所用的材料、试剂、方法、仪器等，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法、仪器。本领域技术技术人员均可通过商业渠道获得。
[0036]如无特别说明，本申请中试剂的浓度均为质量浓度；如无特别说明，本专利技术中涉及的实验技术均采用生物学中的通用方法。所用的PBS是购自北京索莱宝科技有限公司的型号为P1020的PBS溶液；所用的胰蛋白酶是购自Gibco的25200072；CCK8试验所用的试剂盒为美仑MA0218<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，将经过预处理的离体新鲜小鼠乳腺癌组织碎块进行清洗后，放入到胶原酶I溶液中进行消化处理；消化处理后加入培养基混匀后离心留取沉淀物；将所得的沉淀物转移至含培养基的培养瓶内后在培养箱中进行培养，培养48h后开始首次更换全部培养基；培养结束后去除未贴壁细胞即获得目标细胞；更换培养基后培养目标细胞，待目标细胞形成细胞集落，细胞融合度达到70％后即获得可传代培养的小鼠乳腺癌细胞，分离培养结束。2.根据权利要求1所述的小鼠乳腺癌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤如下：(1)将经过预处理新鲜离体的小鼠乳腺癌组织标本切成1mm3大小的组织碎片，并利用PBS清洗两次；(2)将步骤(1)中经过清洗的组织块放入到盛有胶原酶I的EP管内，进一步粉碎成肉泥后消化3min；(3)向步骤(2)经过消化后的溶液中加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，混合均匀后，离心留取沉淀物；(4)将步骤(3)所得沉淀物转移至含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶后放在培养箱内进行培养，培养48h后开始首次换液，当培养至无悬浮组织块时培养结束，培养结束后去除未贴壁细胞，获得目标细胞；(5)使用配方为：89％DMEM/F12+10％FBS+1％三抗的完全培养基培养步骤(4)的目标细胞；培养3～7天当细胞集落形成，细胞融合度达到70％后，即获得可传代培养的小鼠乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：李楠，王宇心，陈思，
申请(专利权)人：哈尔滨中科赛恩斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：