一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂及其制备方法和用途，制备方法包括：粗提，热处理：将所述粗提液加热后，冷却至室温，之后进行离心处理取上清液，即为粗蛋白酶抑制剂溶液；超滤膜分离：将所述粗蛋白酶抑制剂溶液先采用截留分子量为14

【技术实现步骤摘要】
一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及蛋白酶抑制剂领域，尤其是一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase，PEP)是丝氨酸蛋白酶家族中一种特殊的蛋白酶，其只能降解含脯氨酸残基并且小于33个氨基酸残基的肽链。这一特性明显区别于丝氨酸蛋白酶家族，表明PEP蛋白构象与丝氨酸蛋白酶家族的其他酶类不同，属于新型丝氨酸蛋白酶。
[0003]现阶段，PEP已经从哺乳动物、水产动物、植物、真菌等多种不同来源分离得到，不同生物学来源的PEP有一定的相似性，同时也存在差异性。目前，PEP共有的特性表现在其通过降解含脯氨酸残基的肽激素和神经肽，在学习和记忆、DNA合成、细胞分化和信号转导中发挥作用。一些特殊来源的PEP也具有一些独特的性质，例如微生物来源的PEP可以被利用来在牛奶和乳清产品中除苦，在啤酒的发酵中可以用来降低啤酒浑浊度。
[0004]脯氨酰内肽酶抑制剂，简称PEPI，顾名思义，其可以抑制脯氨酰内肽酶的活性。目前，脯氨酰内肽酶抑制剂已经商品化，并在临床上得到广泛的运用，例如：能降解血管加压素、血管紧张素、神经紧张素、催产素、促甲状腺素释放激素等。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法和用途，所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂从鲍鱼内脏中获得，该来源的脯氨酰内肽酶天然抑制剂具有良好的热稳定性和pH稳定性，对PEP具有强抑制作用。具体表现为，在40
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90℃下能够保持90％以上的抑制活性，当加热到90℃时，依然具有80％的相对抑制活性。在pH 5.0
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12.0的范围内能够保持80％及以上的抑制活性，在pH3.0
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4.0强酸条件下，其抑制活性仍然在60％及以上。
[0006]专利技术人通过研究发现鲍鱼中存在脯氨酰内肽酶，专利技术人认为，基于生物体的自身平衡机制，鲍鱼肉中可能存在相应的抑制剂，经过不断尝试，终于从鲍鱼内脏中提取出一种鲍鱼源的脯氨酰内肽酶天然抑制剂(PEPI)。通过SDS
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PAGE研究表明，该PEPI的分子量为12kDa左右，与已有报道的其他水产动物来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂相比较小，属于低分子量丝氨酸蛋白酶抑制剂。通过PAS染色确定PEPI为糖蛋白，表明PEPI中含有寡糖链，经过碘酸氧化后与无色品红结合，形成紫红色染料沉积在蛋白上，从而使蛋白呈现紫红色。
[0007]目前，普拉西坦、JTP
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4819、S
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17092和KYP
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2047等化学合成的PEP抑制药物，在神经保护和认知增强方面均已表现良好的临床治疗效果。动物和植物源的生物活性肽也有报道具有抑制PEP活性。需要说明的是，专利技术人从鲍鱼中获得的脯氨酰内肽酶天然抑制剂，目前研究发现仅对鲍鱼的脯氨酰内肽酶有特异性抑制作用，不是市售和现有技术所公开的脯氨酰内肽酶抑制剂。
[0008]基于偶然因素，专利技术人将新鲜鲍鱼肉浸泡于本专利技术提取的鲍鱼源的脯氨酰内肽酶
天然抑制剂和金属蛋白酶抑制剂(EDTA)组成的溶液中，发现鲍鱼的自溶明显减缓，进一步研究发现，本专利技术所述制备方法获得的脯氨酰内肽酶天然抑制剂和金属蛋白酶抑制剂结合后具有一个全新的作用，即抑制鲍鱼自溶。
[0009]鲍鱼贮藏过程中，鲍鱼肌肉中的胶原蛋白发生降解，产生自溶现象，这导致鲍鱼变质，是目前鲍鱼保鲜中存在的极大难题。本专利技术创造性地将鲍鱼源脯氨酰内肽酶天然抑制剂(PEPI)与基质金属蛋白酶抑制剂(例如EDTA)混合后用于鲍鱼的保鲜，抑制鲍鱼贮藏过程中肌肉中胶原蛋白自身降解，从而防止鲍鱼贮藏过程中肌肉的降解，最终起到保鲜的效果。
[0010]具体方案如下：
[0011]一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法，包括：
[0012]粗提：将鲍鱼内脏组织捣碎，加水进行离心处理取上清液，即为粗提液；
[0013]热处理：将所述粗提液加热后，冷却至室温，之后进行离心处理取上清液，即为粗蛋白酶抑制剂溶液；
[0014]超滤膜分离：将所述粗蛋白酶抑制剂溶液先采用截留分子量为14
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20KDa的超滤膜进行分离，收集透过液；然后将所述透过液用截留分子量为5
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10KDa的超滤膜进行分离，收集未透过超滤膜的浓缩液，得到分子量为11
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13KDa的蛋白酶抑制剂浓缩液；
[0015]干燥制粉：将所述蛋白酶抑制剂浓缩液进行干燥、制粉，得到粉末，即为脯氨酰内肽酶天然抑制剂。
[0016]进一步的，所述粗提中，鲍鱼内脏与水的体积比为1：3
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5，鲍鱼内脏置于水中进行组织捣碎，离心处理的重力加速度为8000
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12000g，时间为15
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30min。
[0017]进一步的，所述热处理的加热温度为80
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90℃，加热时间为10
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20min；冷却至室温，之后进行离心处理，离心处理的重力加速度为8000
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12000g，时间为15
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30min。
[0018]进一步的，所述超滤膜分离，是将将所述粗蛋白酶抑制剂溶液先采用截留分子量为14
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16KDa的超滤膜进行分离，收集透过液；然后将所述透过液用截留分子量为8
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10KDa的超滤膜进行分离，收集未透过超滤膜的浓缩液，得到分子量为11
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13KDa的蛋白酶抑制剂浓缩液。
[0019]进一步的，所述干燥制粉为冷冻干燥制粉、喷雾干燥制粉中的一种。
[0020]本专利技术还保护一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂，运用所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法制备得到，所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂含有分子量为11
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13kDa的脯氨酰内肽酶抑制组分；在温度为40
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90℃，pH＝5
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12范围环境下，所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂对鲍鱼脯氨酰内肽酶的活性抑制率大于等于80％。
[0021]本专利技术还保护所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂在鲍鱼保鲜上的运用。
[0022]本专利技术还保护一种鲍鱼保鲜剂，包含所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂，还包括基质金属蛋白酶抑制剂。
[0023]进一步的，所述基质金属蛋白酶抑制剂为EDTA，所述鲍鱼保鲜剂中所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂和所述基质金属蛋白酶抑制剂的质量比为1～2:1～2。
[0024]本专利技术还保护一种鲍鱼保鲜的方法，采用所述鲍鱼保鲜剂，将所述鲍鱼保鲜剂溶于水中，获得质量浓度0.1
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10％的保鲜剂溶液；之后将需要保鲜的鲍鱼肉放入所述保鲜剂溶液中浸泡，温度为0
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8℃，浸泡时间为20
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60min；最后捞出鲍鱼肉，沥干水后置于0
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4℃环境下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法，其特征在于：包括：粗提：将鲍鱼内脏组织捣碎，加水进行离心处理取上清液，即为粗提液；热处理：将所述粗提液加热后，冷却至室温，之后进行离心处理取上清液，即为粗蛋白酶抑制剂溶液；超滤膜分离：将所述粗蛋白酶抑制剂溶液先采用截留分子量为14
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20KDa的超滤膜进行分离，收集透过液；然后将所述透过液用截留分子量为5
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10KDa的超滤膜进行分离，收集未透过超滤膜的浓缩液，得到分子量为11
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13KDa的蛋白酶抑制剂浓缩液；干燥制粉：将所述蛋白酶抑制剂浓缩液进行干燥、制粉，得到粉末，即为脯氨酰内肽酶天然抑制剂。2.根据权利要求1所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法，其特征在于：所述粗提中，鲍鱼内脏与水的体积比为1：3
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5，鲍鱼内脏置于水中进行组织捣碎，离心处理的重力加速度为8000
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12000g，时间为15
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30min。3.根据权利要求1或2所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法，其特征在于：所述热处理的加热温度为80
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90℃，加热时间为10
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20min；冷却至室温，之后进行离心处理，离心处理的重力加速度为8000
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12000g，时间为15
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30min。4.根据权利要求1或2所述脯氨酰内肽酶天然抑制剂的制备方法，其特征在于：所述超滤膜分离，是将所述粗蛋白酶抑制剂溶液先采用截留分子量为14
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16KDa的超滤膜进行分离，收集透过液；然...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹敏杰，杜雪莉，章骞，杨汝晴，翁凌，陈玉磊，孙乐常，张凌晶，刘光明，
申请(专利权)人：四川威尔检测技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：