一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。该引物组的序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用。

技术介绍

[0002]结核病是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道传染病。2017年WHO报道，2016年全球约有170万人死于结核病，新增患者1040万人。如果能够早期诊断结核病并且得到有效的治疗，大多数结核病患者能够免于死亡。虽然在2000年至2016年间，有约5300万诊断为结核病的患者通过治疗而被治愈，但是这仍与被检测出的结核病患者在数量上相差很大。
[0003]结核是常见并可致命的一种传染病，由分枝杆菌又称结核杆菌导致。结核通常感染并破坏肺以及淋巴系统，但其它器官如脑、中枢神经系统、循环系统、泌尿系统、骨骼、关节、甚至皮肤亦可受感染。其他的分枝杆菌，如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、田鼠分枝杆菌亦可引起结核，但通常不感染健康成人。抗生素类药物是治疗结核病的主要手段，随着抗生素的广泛使用导致了耐药菌株的出现，特别是耐多药结核菌和广泛耐药结核菌的流行和传播引起了全球各国学者的极大关注。
[0004]在临床实验室检测分枝杆菌时，常用方法包括涂片法、培养法等传统的检测方法。但传统的检测方法已经不能准确、全面地判断病人的患病信息。如敏感性差，对于肿瘤和血液病患者，50％的血培养阴性最终发现侵袭性念珠菌感染；阳性培养结果仅反映真菌存在，不能区分定植和感染；培养周期长；某些样本难以获得等问题。因此，有必要建立快速、敏感、特异的理想诊断方法。
>[0005]基质辅助光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
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MS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。MALDI
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MS技术是一种新型的软电离生物分子质谱分析平台，通过激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量并传递给生物分子，促使生物分子电离并在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间来直接测算生物大分子的分子量，准确识别延伸引物是否连接上特定的碱基，进而准确分析样本中的特定基因位点信息。MALDI
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MS技术具有灵敏度高、检测速度快、样本用量少、高通量等特点，可作为分枝杆菌菌种鉴定和耐药突变检测的诊断方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的样本处理方法，其包括以下步骤：
[0007]1)根据专家共识和文献资料，确定常见的26种分枝杆菌作为检测目标，并根据流行病学将其分成2个pool，分开检测。Pool 1可以鉴定9种结合分枝杆菌，包含结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌；Pool 2可以鉴定剩余17种结合分枝杆菌，包含耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、猪分枝杆菌、土分枝杆菌、不产色分枝杆菌、结核分枝杆
菌复合群、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、次要分枝杆菌、胃分枝杆菌、母牛分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、新金色分枝杆菌、金色分枝杆菌。
[0008]2)根据文献资料，初步确立分枝杆菌的特异性基因，涉及16S、ITS1、gyrA、rpoB、gyrB、IS6110、IS1311、gnd、dnaA、dnaJ。为了保证方法的准确性，需要尽可能多的从NCBI数据库下载到分枝杆菌的上述基因序列，同时下载部分非分枝杆菌的同源基因作为对照序列。使用clustalx软件对下载的基因序列进行同源性比对，寻找不同分枝杆菌各自的特异性区间和位点，用于扩增引物和延伸引物的设计。例如gyrA基因同源性比对结果(参见图1)显示瘰疬分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、胃分枝杆菌、浅黄分枝杆菌七种分枝杆菌的gyrA基因比其他同源基因相比，在gyrA基因的5
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端多出一段特异性的序列，可以作为扩增引物和延伸引物的设计区间。考虑到后续引物设计的不确定性，不能保证每个特异性区间都适合设计引物，还要考虑不同引物之间的引物二聚体，所以在筛选特异性的序列时，每种分枝杆菌应至少寻找到两个合适的特异性区间。
[0009]3)除了上述每种分枝杆菌的特异性区间外，还需要增加两个质控片段，一个是人类基因组片段，检测样本携带有人基因组背景，新增一个人类基因组检测区间可以用于质控样本的质量和实验操作流程；一个是分枝杆菌的高度保守的检测区间，即可以作为阳性结果的质控，又可以检测出26种分枝杆菌外的其他分枝杆菌，提示有分枝杆菌感染。
[0010]4)基于每个检测区间进行扩增引物和延伸引物的设计。引物设计过程中特异性区间少的分枝杆菌优先设计，两个质控片段放在最后。设计引物的过程中要保证引物3
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端和延伸碱基的特异性，设计出来的引物要跟前面设计好的引物进行引物二聚体分析，可以借助Multiple PrimerAnalyzer程序进行多重引物分析，存在严重的引物二聚体或引物3
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端非特异性结合现象就剔除，重新设计。
[0011]5)以临床样本和国家参考品为模板，对设计好的扩增引物和延伸引物进行筛选和验证。其中扩增引物以毛细管电泳技术为检测方法，检测是否存在目的扩增片段，是否有明显的非特异片段；延伸引物则以核酸质谱技术为检测方法，检测是否存在目的延伸产物，是否有非特异延伸，最终确认的引物序列如下：
[0012][0013][0014][0015]所述一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的样本处理方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品、痰液样品、细胞样品DNA同样的扩增和检测能力。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]本专利技术基于基质辅助光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
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MS)技术，能够同时进行26种分枝杆菌菌种鉴定。
[0018](1)本专利技术基于核酸质谱平台，整体流程包含三轮PCR扩增和最终的质谱上机检测。仅需简单的加样、离心的操作即可完成PCR扩增流程，而质谱上机检测流程则由仪器自动化检测，因此本专利技术操作简便，手动操作时间短，当天即可得到检测结果；
[0019](2)本专利技术的检测范围涵盖26种分枝杆菌特异性区间和一个分枝杆菌的高度保守的检测区间。可以同时检测出26种分枝杆菌；此外分枝杆菌的高度保守的检测区间，即可以作为阳性结果的质控，又可以检测出26种分枝杆菌外的其他分枝杆菌，提示有分枝杆菌感染。
[0020](3)本专利技术从原料筛选开始，构建了一套适用于核酸质谱平台的检测体系，降低检测成本。
附图说明
[0021]图1为gyrA基因同源性比对结果图。
[0022]图2a为实施例1中最低检出量参考品S1的检测结果图。
[0023]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌用的引物组，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO.1
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85所示。2.一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中的引物组。3.一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的样本处理方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1中的引物组对样本DNA进行PCR扩增的步骤。4.如权利要求3所述的基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)富集扩增：按照“3μL的富集反应液1或富集反应液2分别添加0.05μL Taq酶”的比例各配置若干人份的富集反应体系1和富集反应体系2，混匀离心后按照每人份3μL的体积分装至96孔板中；加有富集反应体系1的反应孔标记Pool1，加有富集反应体系2的反应孔标记Pool2，每个样品需分别取2μL核酸原液加入到标记Pool1和Pool2的反应孔中，每两孔检测一份样本，后进行PCR扩增；(2)消化反应：按照“1.5μL的消化反应液+0.5μL SAP酶”的比例配置若干人份的消化反应体系，...

【专利技术属性】
技术研发人员：康灿昆，甘煌灿，施佳青，陈琰，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：