滞留层析和蛋白质芯片排列在生物学和医学上的应用制造技术

本发明专利技术提供了用滞留层析分辨样品中分析物的方法。该方法涉及在多种选择性条件下让分析物吸附于基质上，和用解吸谱法检测滞留在基质上的分析物。这些方法可用于生物学和医药学，包括临床诊断和药物开发。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为1998年6月19日，申请号为98808077.X，名称为“滞留层析和蛋白质芯片排列在生物学和医学上的应用”的专利技术专利申请的分案申请。
技术介绍
本专利技术涉及分离技术和分析生物化学。本专利技术的方法可用于生物学或医药，包括分析基因功能，基因差异表达，蛋白质的发现，细胞和临床诊断，以及药物筛选。不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的基因(即基因功能)。基因的表达有质与量两方面的内容。即，细胞在所表达的特定基因和同一基因的相对表达量上都可能不同。基因的差异表达表现在，例如，基因编码蛋白质表达的差异，或所表达蛋白翻译后修饰的差异。例如，蛋白质可以被糖基或磷酸基修饰，也可以通过肽剪切加工。所以，在生物化学水平上，细胞代表着有机生物分子的复杂混合物。基因组学(genomics)(“蛋白组学(protomics)”)的目的之一是鉴定和描述由不同细胞差异表达的有机生物分子。通过比较表达情况可以’鉴定出造成细胞特定病理活性的分子。例如，鉴定出只在癌细胞内表达而不在正常细胞内表达的蛋白质可用于诊断，并最终用于药物开发和疾病治疗。人类基因组计划一旦完成，将完成人类全部基因的克隆，测序，并组织成数据库。在这一“后基因组”世界，鉴定差异表达的蛋白质的能力将继而使人能够鉴定编码它们的基因。这样，将可用遗传学来解决细胞功能问题。基因表达和功能的差异化学分析需要能够分辨细胞内分子的复杂混合物，即使它们以微量存在，并加以定量和鉴定的方法。但是，目前用于这一目的的分析化方法在上述各方面都有局限。一种常用的生物分子分离方法是凝胶电泳。通常是用凝胶内等电点聚焦先分离蛋白质，再用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行第二次分离。结果得到一张根据等电点范围(净电荷)和大小(质量)来区分蛋白质的图。虽然有用，但是该方法存在以下几方面的局限。首先，该方法只提供生物分子的两项特征一质量和等电点(pI)。其次，各维度(dimension)的分辨率受到凝胶分辨能力的限制。例如，通常很难区分质量差异小于5％或pI差异小于0.5的分子。第三，凝胶的容量和灵敏度都有限；可能无法检测出少量表达的生物分子。第四，无法观察到分子量低于约10-20kDa的小蛋白或小肽。其它分析方法可能克服以上局限之一或几项，但是难以将它们有效组合。例如，分析层析能够根据多种分析物/吸附剂相互作用来分离生物分子，但是作多纬度(multi-dimensional)分析却困难而费时。而且，该方法的灵敏度也很有限。临床诊断要求能够特异性地检测出疾病的已知标记。但是，制备特异性结合标记或能在复杂的混合物中鉴别出标记的试剂需要大量时间，这阻碍了此类诊断方法的发展。药物开发要求迅速筛选出调节配体/受体相互作用的药物。通常，这类筛选中的限速步骤是对配体/受体相互作用的检测能力。所以，鉴定结合的迅速特异性方法将是该领域的一大进展。至今，从鉴定潜在标记或配体/受体对的成员到产生药物这一过程一直很难。在一种方法中，将正常组织与病理组织相比，鉴定在病理组织中mRNA的增加或减少或被表达的序列标签(“EST”)。用常规重组DNA法分离出这些序列并产生它们编码的多肽。然后，将这些多肽分离出来用作免疫原提供标记的特异性抗体。这些抗体可以用于例如ELISA试验中测定患者样品中的标记含量。该方法费时而费事。产生所述抗体可能需要9个月到1年，其中许多时间耗费在开发能够分离出足量多肽以用于免疫的方法上。而且，该方法寄希望于RNA表达的差异所表现的就是蛋白质表达的差异。但是，这一假设并不一定正确。所以，直接检测被差异表达的蛋白并且能够在明显缩短的时间内产生特异性配体的方法将对该领域大有裨益。所以，分析生物化学、生物学和医药领域所需要的是能够分辨有机生物分子的复杂混合物，鉴定混合物中各生物分子并鉴定出涉及一种或多种靶分析物的特异性分子识别的方法。专利技术概述本专利技术提供了进行滞留层析的装置和方法。滞留层析是一种组合方法，它使用多维度分离方法提供复杂混合物中分析物的高分辨信息。它为生物学和药学提供了统一的分析物检测和功能分析能力，其特征在于是一个直接检测与基因功能、蛋白质功能、细胞功能和生物体整体功能相关的分析物表达方式的单一完整操作系统。本
技术实现思路
之一提供一种统一的操作系统，用于基因功能、蛋白质功能、或整个大分子组功能、细胞功能和生物体整体功能的发现和诊断。更具体的说，可以多种两维度形式分辨分析物，从而提供多维度信息。首先，根据分析物在至少两种不同选择性条件下吸附于固定相的能力(例如阴离子/阳离子，疏水性/亲水性，或特异性生物分子识别作用)在至少两种不同的第一维度上分离分析物。然后，用解吸谱(例如激光解吸质谱)根据质量在第二维度上分离分析物，进一步检测已分离的分析物。分析物所吸附的吸附剂的性质提供了分析物的物理-化学信息。所以，本专利技术提供了一种分子发现和诊断装置，其特征在于具有并行和多路分析物处理能力。因为是对分析物的直接检测，本专利技术能够在一个操作单元中从同一循环(“circuit”)同时发出两种或更多种靶分析物的信号(即，可定址的“芯片”位置)。滞留层析与常规层析存在以下区别。首先，滞留层析中检测的是滞留在吸附剂上的分析物。在常规层析中，分析物先从吸附剂上洗脱，然后进行检测。在常规层析中没有常规或方便的方法来检测不从吸附剂上洗脱的分析物。所以，滞留层析提供了有关滞留分析物化学或结构特征的直接信息。第二，吸附层析与解吸谱检测相结合提供了毫微微摩尔级的优良灵敏度以及极高的分辨率。第三，在一定程度上，因为允许直接检测分析物，滞留层析提供了用多种不同选择性条件迅速分析滞留物的能力，由此提供对样品中分析物的快速多维度描述。第四，吸附剂可以于预先确定的排列、可定址位置附着于基质上。这就能够对在不同洗脱条件下接触不同吸附位置(即，“亲合性位置”或“位点”)的分析物进行并行处理。滞留层析在生物学和药学上具有诸多用途。其中包括组合在一起的分析物生物化学分离与纯化，基因差异表达和分子识别的研究，诊断和药物开发。滞留层析作为分析手段的一种基本用途包括样品与不同吸附剂/洗脱剂组合接触，检测分析物在不同条件下的表现。这样，既纯化了分析物又确定了用于检测样品中某分析物的条件。带有由此鉴定的吸附剂的基质可用作某分析物或多种分析物的特异性检测剂。在一种逐步提取法中，样品与第一吸附剂/洗脱剂组合接触并洗涤，去除了被第一吸附剂吸附的分析物再与第二吸附剂接触，从中去除其它分析物。在制备性纯化过程中也可以使用经鉴定可滞留分析物的选择性条件，此时，含有分析物的不纯样品依次接触保留分析物的吸附剂，从而去除杂质，再从吸附剂上收集滞留的分析物进行下一轮。 本
技术实现思路
之一是，直接检测以排列内可定址位置上特定选择性条件为特征的各类或各种分子识别的情况(例如靶吸附剂-靶分析物的相互作用)，同时，被结合的分子仍然位于(即，滞留在)可定址的位置上。也就是说，直接的选择和检测不需要洗脱、回收、扩增或标记靶分析物。本专利技术另一方面的内容是，检测可定址排列内一处或多处的一种或多种分子识别情况只需取出或消耗吸附剂-分析物总量中很小的一部分。这样，未用过的部分可以经一种或多种原位(即在可定址位置内)“二次处理”进一步测知其结构和功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在样品中检测多肽分析物的方法，包括的步骤有：　　　　ａ）将样品与１０至１０，０００种位于不同可定址位置上的不同选择性条件接触，每一种选择性条件由含多肽的生物特异性相互作用吸附剂与洗脱剂的组合确定，接触包括：（Ⅰ）将样品与结合在基质上的生物特异性相互作用吸附剂接触，和（Ⅱ）用洗脱剂从生物特异性相互作用吸附剂上洗去未结合多肽而使得多肽分析物滞留在生物特异性相互作用吸附剂上；和　　　　ｂ）通过各基质上不同可定址位置的激光解吸质谱检测各生物特异性相互作用吸附剂上滞留的多肽分析物。

【技术特征摘要】
US 1997-6-20 60/054,333;US 1997-12-1 60/067,4841.一种在样品中检测多肽分析物的方法，包括的步骤有a)将样品与10至10,000种位于不同可定址位置上的不同选择性条件接触，每一种选择性条件由含多肽的生物特异性相互作用吸附剂与洗脱剂的组合确定，接触包括(I)将样品与结合在基质上的生物特异性相互作用吸附剂接触，和(II)用洗脱剂从生物特异性相互作用吸附剂上洗去未结合多肽而使得多肽分析物滞留在生物特异性相互作用吸附剂上；和b)通过各基质上不同可定址位置的激光解吸质谱检测各生物特异性相互作用吸附剂上滞留的多肽分析物。2.如权利要求1所述的方法，所述样品是选自体液，细胞裂解物，组织裂解物和器官裂解物的生物样品。3.如权利要求1所述的方法，所述生物特异性相互作用吸附剂包含受体。4.如权利要求1所述的方法，所述生物特异性相互作用吸附剂包含细胞表面受体，细胞质受体或核受体。5.如权利要求1所述的方法，所述生物特异性相互作用吸附剂包含酶。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：TW赫琴斯，TT耶，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]