一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4

【技术实现步骤摘要】
一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4
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甲基转移酶及其应用


[0001]本专利技术涉及一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4
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甲基转移酶及其应用，属于基因和代谢工程领域。

技术介绍

[0002]淫羊藿是传统的中草药，具有多种医药保健功能，如抗肿瘤、缓解糖尿病并发症、抗衰老、抗抑郁等作用。其中朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)作为淫羊藿的道地药材，药用价值高。淫羊藿中主要的成分为淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C，上述主要成分都是由淫羊藿素在不同位置糖基化获得，因此淫羊藿素是淫羊藿苷等主要成分的前体。淫羊藿苷等属于植物天然产物，植物提取法是植物天然产物的主要获取途径，而微生物法合成植物天然产物因不受季节影响、能耗低，污染少等优点，成为具有潜力的获取植物天然产物的替代方案。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了朝鲜淫羊藿来源的黄酮4
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甲基转移酶，为(a)或(b)：
[0004](a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0005](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄酮4
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甲基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0006]本专利技术还提供了编码所述黄酮4
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甲基转移酶的基因。/>[0007]在一种实施方式中，所述基因具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
[0008]本专利技术还提供一种表达载体，所述的表达载体携带SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
[0009]本专利技术提供一种含有所述基因或表达所述4
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甲基转移酶的微生物细胞。
[0010]本专利技术还提供了含有所述基因或所述表达载体的微生物细胞。
[0011]在一种实施方式中，所述微生物细胞的基因组上整合了SEQ ID NO.8所示的基因。
[0012]在一种实施方式中，所述微生物细胞中含有携带SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。
[0013]在一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母菌株C800(CEN.PK2
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1D；MATα；ura3
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52；leu2
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3,112；trp1
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289；his3Δ1；MAL2
‑8C
；SUC2；gal80::KanMX)(公开于论文Gao,S.；Zhou,H.；Zhou,J.,et al.,Promoter
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library
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based pathway optimization for efficient(2S)
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naringenin production from p
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coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae[J].J Agric Food Chem 2020,68(25),6884
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6891.)。
[0014]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是以酿酒酵母菌株C800为宿主，表达SEQ ID NO.1所示的4
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甲基转移酶或含有连接了SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。
[0015]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID NO.1所示的4
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甲基转移酶或含有连接了SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒。
[0016]本专利技术提供了构建所述重组微生物细胞的方法，所述方法是将SEQ ID NO.8所示的基因连接至pY26
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PGAL7
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EGFP中EGFP基因所在位置，替换EGFP基因，再将重组质粒转入酿酒酵母C800中，构建得到重组酿酒酵母。
[0017]本专利技术还提供了一种产4
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甲基转移酶的方法，是将所述重组微生物细胞接种至培养基中，于28～37℃培养至少12h。
[0018]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞为重组大肠杆菌，所述培养基为LB培养基。
[0019]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌接种至LB培养基中，于35～40℃培养至OD
600
为0.04～0.06，加入终浓度为0.01～1mM的IPTG，于28～30℃诱导表达至少8h。
[0020]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞为重组酿酒酵母，所述方法是将酿酒酵母先接种至YNB培养基中培养获得种子液，再将种子液转移至YPD培养基中，于28～32℃培养至少20h，获得4
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甲基转移酶。
[0021]在一种实施方式中，所述方法是将所述重组酿酒酵母接种至培养基中培养，并在接种后每10～14h加入底物8
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异戊烯基山奈酚，培养至少72h。
[0022]在一种实施方式中，所述方法还包括收集细胞培养液中的4
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甲基转移酶。
[0023]在一种实施方式中，所述方法具体为：收集细胞培养液中的细胞，破碎细胞，离心分离细胞破碎物，收集离心后的上清液。
[0024]本专利技术还提供一种生产淫羊藿素的方法，是将所述重组酿酒酵母或其代谢产物接种至含8
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异戊烯基山奈酚的培养基中，将8
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异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素。
[0025]在一种实施方式中，所述方法是将1mg的EkF4
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OMT酶催化50μM的底物8
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异戊烯基山奈酚，30℃反应至少4h。
[0026]本专利技术还提供所述重组酿酒酵母在制备微生物细胞催化剂方面的应用。
[0027]本专利技术还提供所述重组酿酒酵母在生产含淫羊藿素的医用营养品或药物中的应用。
[0028]本专利技术的有益效果：本专利技术首次从朝鲜淫羊藿中筛选获得了具有专一的底物识别作用的黄酮4
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甲基转移酶，可以通过在微生物细胞中异源表达合成淫羊藿素。本专利技术构建的重组酿酒酵母菌株可以催化50mg/L的8
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异戊烯基山奈酚，获得2.0mg/L的淫羊藿素，而纯酶催化体系中可以催化50μM的8
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异戊烯基山奈酚(约17.7mg/L)获得5.7μM的淫羊藿素(约2.11mg/L)，相对于传统的植物提取方法，本专利技术的微生物转化法在食品、医药领域有巨大的应用前景。
附图说明
[0029]图1为8
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异戊烯基山奈酚经过EkF4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.朝鲜淫羊藿来源的黄酮4
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甲基转移酶，其特征在于，为(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄酮4
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甲基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述黄酮4
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甲基转移酶的基因。3.一种表达载体，其特征在于，携带SEQ ID NO.8所示的基因。4.含有权利要求2所述基因或表达权利要求1所述黄酮4
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甲基转移酶的微生物细胞。5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，含有携带SEQ ID NO.8所示基因的重组质粒，或在基因组上整合了SEQ ID NO.8所示的基因。6.一种产黄酮4
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甲基转移酶的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的微生物细胞接种至培养基中，于28～37℃培养至少12h，收集黄酮4
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【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，高松，陈坚，曾伟主，余世琴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：