细胞穿透抗体制造技术

本文提供了细胞穿透缀合物。所述缀合物包括非细胞穿透蛋白，所述非细胞穿透蛋白通过非共价接头附着至硫代磷酸核酸或硫代磷酸聚合物骨架，其中所述非共价接头包括生物素结合结构域和生物素结构域，其中所述硫代磷酸核酸或硫代磷酸聚合物骨架增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。还提供了包含所述缀合物的组合物和试剂盒。和试剂盒。和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
细胞穿透抗体
[0001]本申请为申请日为2016年1月15日、申请号为201680015852.5、专利技术名称为“细胞穿透抗体”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2015年1月16日提交的美国专利申请号62/104,653的优先权，其以整体援引加入本文。
[0004]对于联邦资助的研发中所得出的专利技术权利的声明
[0005]此专利技术使用了国立卫生研究院(National Institutes of Health)所授予的项目编号CA122976的支持。政府对此专利技术有一定的权利。
[0006]专利技术背景
[0007]抗体由于其相对于其它类型的药物(如小分子药物)而言易于产生、特异性和生物持久性，而已经证明为有效的药物形态。目前的抗体治疗仅能够靶向于细胞外分子。然而，许多用于疾病治疗和疾病诊断的重要靶标是细胞内的。例如，许多转录因子，如STAT3，就属于用于癌症治疗的最关键但却具有挑战性的靶标。本文提供了用于本领域中这些和其它需求的解决方案。
[0008]专利技术概述
[0009]在一方面，提供了细胞穿透缀合物。所述细胞穿透缀合物包括(i)非细胞穿透蛋白、(ii)硫代磷酸核酸和(iii)将硫代磷酸核酸附着至所述非细胞穿透蛋白的非共价接头。所述非共价接头包括非共价附着至生物素结构域的生物素结合结构域，并且所述硫代磷酸核酸增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。
[0010]在另一方面，提供了形成细胞穿透缀合物的方法。所述方法包括使非细胞穿透蛋白与硫代磷酸核酸接触，其中所述非细胞穿透蛋白附着至生物素结合配对的第一成员并且所述硫代磷酸核酸附着至生物素结合配对的第二成员，由此形成细胞穿透缀合物，其包括生物素结构域和生物素结合结构域之间的非共价键。
[0011]在另一方面，提供了细胞，其包括本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)。
[0012]在另一方面，提供了药物组合物，其包括本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)和药物可接受的载体。
[0013]在另一方面，提供了试剂盒，其包括本文提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)或者本文所提供的药物组合物(包括其实施方案)以及使用说明。
[0014]在另一方面，提供了将非细胞穿透蛋白递送至细胞内的方法。所述方法包括使所述细胞与本文所提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)接触。
[0015]在另一方面，提供了在有需要的对象中治疗疾病的方法。所述方法包括向对象施用有效量的本文所提供的细胞穿透缀合物(包括其实施方案)，由此在所述对象中治疗疾病。
[0016]附图简述
[0017]图1:缀合方案:亲和素缀合至抗体/肽以及生物素
‑
寡聚物缀合至亲和素。(1)IgG的亲和素化(avidinylation)；(2)添加生物素化的递送实体(也即PS
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寡聚物)。可以使用链
霉亲和素(或亲和素衍生物)来代替亲和素；链霉亲和素提供了接受4个生物素的机会，而亲和素只接受1个生物素。PS，硫代磷酸。
[0018]图2:纯化方案:亲和素/生物素推动的缀合提高了分子量，使得能够纯化经修饰的抗体。
[0019]图3:DNA
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寡聚物经亲和素
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生物素而对抗体蛋白的非共价连接，使得抗体/蛋白能够进行细胞穿透/抗原识别。将人神经胶质瘤U251细胞与抗
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STAT3抗体(如所示那样经修饰)以10mg/ml温育1h。制备了全细胞裂解物并清除了细胞碎片，之后添加琼脂糖珠并在4℃摇动下与裂解物温育过夜。蛋白通过SDS
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PAGE进行分离，转移至硝酸纤维膜，并用抗体探测STAT3蛋白。Av，亲和素；SAv，链霉亲和素；B，生物素；PO，磷酸；PS，硫代磷酸。
[0020]图4A和图4B:对于经生物素
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亲和素/链霉亲和素以用于细胞穿透和细胞内靶标识别，抗体蛋白经硫代磷酸化的DNA
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寡聚物附着与抗体蛋白经聚乙二醇化的直接对比。DNA
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寡聚物经亲和素
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生物素而对抗体蛋白的非共价连接优于抗体聚乙二醇化。将人神经胶质瘤U251细胞与抗
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STAT3抗体(兔，如所示那样经修饰)以10mg/ml温育1h。图4A，制备了单细胞悬液，并通过由流式细胞术分析的细胞内染色程序来对兔IgG进行了评估。图4B，制备了全细胞裂解物并清除了细胞碎片，之后添加琼脂糖珠并在4℃摇动下与裂解物温育过夜。蛋白通过SDS
‑
PAGE进行分离，转移至硝酸纤维膜，并探测STAT3蛋白。
‑
PEG，聚乙二醇。
[0021]图5A和图5B:DNA寡聚物对抗体的非共价连接。非DNA寡聚物的蛋白优于乙烯砜化学推动的共价连接。如所示地将10μg/ml抗体与U251细胞温育1h(A，6孔平板；BC，12孔平板)，用PBS洗涤并制备了裂解物；将琼脂糖珠添加至清澈的裂解物并进行了WB。
[0022]图6:通过链霉亲和素/生物素缀合至PS
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DNA寡聚物的经修饰的抗
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STAT3抗体能够进行细胞穿透以及靶标识别。
[0023]图7A和图7B:通过链霉亲和素/生物素缀合至PS
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DNA寡聚物(20聚体)的经修饰的抗
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STAT3抗体在细胞穿透中是最有效的。
[0024]图8A和图8B:通过链霉亲和素/生物素缀合至PS
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DNA寡聚物(20聚体)的经修饰的抗
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STAT3抗体能够进行细胞穿透。
[0025]图9A和图9B:通过链霉亲和素/生物素缀合至PS
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DNA寡聚物(20聚体)的经修饰的抗
‑
STAT3抗体能够进行细胞穿透。
[0026]图10:在用经修饰的抗
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T
‑
Bet抗体治疗后，小鼠B16黑色素瘤的肿瘤生长。在第0日将1
×
105个B16肿瘤细胞皮下注射至C57/BL6小鼠，随后是局部施用载剂(PBS)，经修饰的对照(IgG)和T
‑
bet抗体(10ug/剂量)，从第7日开始。每隔一天给予抗体治疗。SD已显示；T
‑
检验:***)P<0.001。
[0027]图11:经修饰的T
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Bet抗体在肿瘤中增强了表达IFNγ的CD4+和CD8+T细胞。通过流式细胞术对B16肿瘤相关的淋巴细胞分析了CTL成熟和Th1群体以及由CD4+T细胞对T
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bet的表达。
[0028]图12A和图12B:T
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Bet抗体在肿瘤部位促进DC功能。在CD3+或CD3
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肿瘤相关的淋巴细胞(以PBS、未修饰的T
‑
Bet、PO或PS修饰的T<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.细胞穿透缀合物，其包含：(i)非细胞穿透蛋白；(ii)硫代磷酸核酸；和(iii)将所述硫代磷酸核酸附着至所述非细胞穿透蛋白的非共价接头，所述非共价接头包含非共价附着至生物素结构域的生物素结合结构域；和其中所述硫代磷酸核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。2.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述生物素结合结构域是亲和素结构域。3.权利要求1的细胞穿透缀合物，其中所述生物素结合结构域是链霉亲和素结构域。4.权利要求3的细胞穿透缀合物，其中所述链霉亲和素结构域结合多个生物素结构域。5.权利要求4的细胞穿透缀合物，其中所述链霉亲和素结构域结合大约...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：希望之城，
类型：发明
国别省市：