一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRSIPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRSIPR
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Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及食源性致病菌检测
，更具体地，涉及一种基于CRSIPR
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Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌是一种兼性厌氧的细菌，属肠杆菌科，是革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌与其他食源性致病菌如：弯曲杆菌，单增生李斯特菌，金黄色葡萄球菌，产志贺毒素的大肠杆菌等均是导致大量食源性病例的常见细菌。据统计，食品安全事件中细菌性食物中毒事件高达40％，且沙门氏菌引起的中毒事件高居首位。沙门氏菌通常会污染的食物主要有蛋制品，乳制品，肉制品，水生动物也会因水质受到污染而被感染，对人类的健康安全造成极大危害。感染沙门氏菌的临床症状常表现为腹痛，头痛恶心，呕吐，腹泻等，严重者会危及生命。
[0003]在GB29921
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2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》所列出的所有食品类别中，无论是肉制品，粮食制品，饮料，还是即食豆制品，即食果蔬制品，沙门氏菌的限量标准均是一致的，即同一批次采集的5个样品中，沙门氏菌不得检出(n＝5，c＝0)。国际食品微生物标准委员会、欧盟、国际食品法典委员会对各类食品分别做了不同要求，总体上比我国更为严格，有些甚至能达到n＝60，c＝0。因此，沙门氏菌的危害性可见一斑，沙门氏菌的快速检测也一直都是食品安全中的研究重点之一。
[0004]我国现行的沙门氏菌检验标准为GB4789.4
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2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》。该法为最基础最标准的沙门氏菌检验方法，其准确度高，稳定性好，成本低，但其操作复杂，耗时长，需要耗费大量的人力物力。因此，各种快速检测沙门氏菌的技术和方法应运而生，包括基于免疫学的方法，如酶联免疫吸附法和侧流免疫层析法；基于传感器以及适配体的生物技术，如光学生物传感器，电化学生物传感器；基于核酸序列的方法，如PCR，实时荧光定量PCR(qPCR)等。目前各种方法均有各自的局限性，其中基于DNA的分子生物学检测方法因其具有灵敏度高、特异性强、成本低等优点而应用较为广泛。但目前的分子生物学方法对检测人员、样品DNA质量、检测环境要求高，且PCR和qPCR仪价格昂贵，多用于实验室，较难应用到现场快速检测。因此，建立一种同时满足快速、便捷且灵敏度高的沙门氏菌检测方法至关重要，能够为食品安全和人们健康带来保障。
[0005]中国专利CN111961705A公开了一种沙门氏菌的检测方法，是以待测样品的核酸为模板，利用沙门氏菌特异性引物使用环介导等温扩增技术(LAMP)进行扩增，得到扩增产物；再在特异crRNA的介导下，利用CRISPR系统对所得到的扩增产物进行裂解反应，得到裂解产物；最后将得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测；其LAMP扩增时间为1h，且需要65℃，检测时间较长、检测温度较高，同时胶体金检测结果不稳定且需要额外的耗材。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于CRSIPR
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Cas体系的快速沙门氏菌检测方法。先通过对待测样品核酸模板进行恒温扩增反应得到扩增产物，再在特异crRNA的介导下，利用含ssDNA荧光探针的CRISPR
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Cas12a体系对RPA扩增产物进行裂解反应，得到信号产物，最后通过信号产物的显色检测进行判断，简单快捷。
[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种快速检测沙门氏菌的RPA引物和crRNA探针。
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种快速检测沙门氏菌的方法。
[0009]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0010]一种快速检测沙门氏菌的试剂盒，包括RPA引物和crRNA探针；所述RPA引物包括上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，所述crRNA探针序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]所述RPA引物用于先对待测样品核酸使用重组酶聚合酶等温扩增，得到RPA扩增产物，再在特异性crRNA探针的介导下，利用CRISPR
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Cas12a体系对RPA扩增产物进行裂解反应，得到信号产物，从而进行判断。
[0012]优选地，所述试剂盒还包含Cas12a酶和ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针一端采用荧光基团进行修饰，另一端采用淬灭基团进行修饰。
[0013]进一步优选地，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列包括但不仅限于FAM
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TTTTTT
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BHQ，任何DNA单链荧光探针均可实现本专利技术专利技术目的。
[0014]本专利技术还提供所述试剂盒在快速检测沙门氏菌中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种快速检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
[0016]S1.提取待测样品基因组DNA；
[0017]S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述RPA引物进行等温扩增反应，得RPA扩增产物；
[0018]S3.将步骤S2的RPA扩增产物加入到含ssDNA荧光探针、所述crRNA探针的CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到信号产物；
[0019]S4.将步骤S3的信号产物在蓝光下进行显色，若信号产物在蓝光照射下显色无荧光亮度，证明待测样品中无沙门氏菌污染，为阴性(－)；若信号产物在蓝光照射下显色有荧光亮度，证明待测样品中有沙门氏菌污染，为阳性(+)。
[0020]上述检测方法的原理是CRISPR
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Cas12a在crRNA的引导下识别RPA扩增产物中特异性靶标，CRISPR
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Cas12a、crRNA和靶标序列分子结合成复合物；所述复合物切割检测体系内的ssDNA荧光探针，探针分子被切开后，产生大量荧光可被检测。
[0021]优选地，步骤S2所述等温扩增反应的体系为5μL 2
×
Reaction Buffer、1μL10
×
Basic E
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Mix、0.5μL 20
×
Core Reaction Mix、40μM上下引物各0.12μL、0.55μL dNTPs、2μL DNA模板、0.71μL MgOAc加入PCR管中，混匀，覆盖15μL矿物油；37℃孵育25min。
[0022]进一步优选地，所述CRISPR/cas12a体系中，cas12a：crRNA探针：ssDNA荧光探针＝80nM:80nm:200nM。
[0023]进一步优选地，步骤S3所述裂解反应的体系为1μM cas12a酶2μL、1μM crRNA 2μL、10μM ssDNA荧光探针0.5μL、0.8U/μL RNase Inhibitor 0.5μL、2.5μL NEBuffer 2.1、7.5μL ddH2O；37℃孵育5～20min。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，包括RPA引物和crRNA探针；所述RPA引物包括上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，所述crRNA探针序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包含Cas12a酶和ssDNA荧光探针。3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为FAM
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BHQ。4.权利要求1～3任一所述试剂盒在快速检测沙门氏菌中的应用。5.一种快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.提取待测样品基因组DNA；S2.以步骤S1的DNA为模板，利用权利要求1中所述RPA引物进行等温扩增反应，得RPA扩增产物；S3.将步骤S2的RPA扩增产物加入到含ssDNA荧光探针、权利要求1中所述crRNA探针的CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到信号产物；S4.将步骤S3的信号产物在蓝光下进行显色，若信号产物在蓝光照射下显色无荧光亮度，证明待测样品中无沙门氏菌污染；若信号产物在蓝光照射下显色有荧光亮...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈兴，刘莉，张旭，盖作启，王宏，
申请(专利权)人：广州艾迪基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：