一种乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型及其制备方法，属于医药技术领域。本发明专利技术选择4T1乳腺癌细胞株，通过给与小鼠坐骨神经外膜下注射该肿瘤细胞，观察注射后小鼠坐骨神经功能指数及痛觉的变化，初步建立乳腺癌侵袭神经的有效模型，为进一步深入探讨乳腺癌的PNI作用及引起疼痛的机制打下一定的实验基础；对乳腺癌的早期诊断、早期治疗、提高治疗效果及减轻临床乳腺癌患者疼痛尤其是对预防和缓解PMPS有着重要的意义。防和缓解PMPS有着重要的意义。防和缓解PMPS有着重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型及其制备方法


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及一种乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型及其制备方法。

技术介绍

[0002]2020年世界卫生国际癌症研究机构（IARC）发布：乳腺癌取代肺癌成为全球发病率第一的癌症。乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，复发、转移常是其治疗失败的主要原因。嗜神经侵袭(PNI)是继直接蔓延、种植、淋巴转移和血行转移的第5种转移方式，在恶性肿瘤入侵中发挥着重要作用。有研究表明，PNI与浸润性乳腺癌患者的复发及5 年存活率密切相关，是乳腺癌一种重要的预后参数。但目前因缺乏稳定有效的体内PNI模型，使神经侵袭机制的研究进展缓慢。
[0003]此外，早期的乳腺癌并没有任何的症状，也没有任何的疼痛。但若晚期有淋巴结的转移或者是脑转移或者是骨转移，往往会根据转移的部位而出现不同程度的疼痛；13％～53％乳腺癌患者术后存在慢性神经性疼痛（PMPS）。这些类型的疼痛成为众多乳腺癌患者医疗、生活质量和社会心理方面等方面的压力。
[0004]因此，寻找和制备合适的的乳腺癌PNI动物模型用于深入探讨乳腺癌浸润神经并诱发疼痛机制具有重要的医学意义和深远的社会意义。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型及其制备方法。
[0006]本专利技术选择4T1乳腺癌细胞，通过给与小鼠坐骨神经外膜下注射该肿瘤细胞，观察注射后小鼠坐骨神经功能指数及痛觉的变化，初步建立乳腺癌侵袭神经的有效模型，为进一步深入探讨乳腺癌的PNI作用及引起疼痛的机制打下一定的实验基础；对乳腺癌的早期诊断、早期治疗、提高治疗效果及减轻临床乳腺癌患者疼痛尤其是对预防和缓解PMPS有着重要的意义。
[0007]在本专利技术的一个实施例中，所述4T1乳腺癌细胞以细胞悬液的形式给药，所述细胞悬液按如下方法制备：将培养的4T1乳腺癌细胞用0.25％trypsin进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为4T1乳腺癌细胞悬液。
[0008]进一步地，所述4T1乳腺癌细胞悬液中细胞浓度为1
×
10
7 个/mL。
[0009]更进一步地，所述4T1乳腺癌细胞悬液注射用量5μL，行Balb/c小鼠坐骨神经外膜下局部注射。
[0010]所述乳腺癌侵袭神经并诱发疼痛模型的制备方法具体为：使用异氟烷1.5剂量气麻Balb/c小鼠，剃毛，沿坐骨间隙开口，钝性分离筋膜。小心用镊子游离出坐骨神经。把4T1肿瘤细胞用200μl的移液枪吹匀10次左右，注射器吸取5μlL肿瘤细胞，于坐骨神经外膜出平行进针平行进针。注射细胞后停留10s，使液体充分被吸收，
缓慢拔针后缝合。
[0011]肿瘤细胞注射后1周即开始侵袭神经生长，每只小鼠瘤体大小基本一致。注射1周后因肿瘤压迫或浸润引起的坐骨神经功能指数及痛阈值发生显著变化，2w时差异更显著，3周后神经被肿瘤细胞浸润离断，不再感受疼痛刺激。
[0012]本专利技术是首次利用4T1乳腺癌细胞制备得到的乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型。
[0013]本专利技术的乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型成本低，速度快，稳定性好，可重复，值得推广。
附图说明
[0014]图1为实施例1中小鼠4T1乳腺癌细胞培养至90%密度时光镜下的形态（X200）。
[0015]图2为实施例1中肿瘤细胞注射15天后浸润神经生长结果。
[0016]图3实施例1中小鼠坐骨神经外膜下注射4T1细胞后对针刺足底（左）和热刺激（右）所致疼痛的影响。
[0017]图4为实施例1中小鼠坐骨神经外膜下注射4T1细胞后第15d肿瘤浸润生长的坐骨神经切片HE染色。其中：左图为低倍切片形态；右图为高倍镜下切片形态。
具体实施方式
[0018]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0019]实施例14T1是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6
‑
硫鸟嘌噙抗性细胞株，可以贴壁生长，在BALB/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近。这种肿瘤是人VI期乳腺癌的动物模型。4T1
‑
诱导的肿瘤在手术后及未手术情况下转移的动力学相近，可以用作手术后及未手术模型。
[0020]本实施例选择4T1乳腺癌细胞株，通过给与小鼠坐骨神经外膜下注射该肿瘤细胞，观察注射后小鼠坐骨神经功能指数及痛觉的变化，初步建立乳腺癌侵袭神经的有效模型。
[0021]具体过程如下：（1）细胞培养将冻存的4T1细胞系解冻复苏之后，置于含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液中，将接种了细胞的培养皿置于体积分数为5%CO2、饱和湿度的37℃培养箱中培养。
[0022]小鼠4T1乳腺癌细胞培养至90%密度时光镜下的形态，如图1所示。
[0023]（2）坐骨神经外膜下注射将培养的4T1乳腺癌细胞用0.25％trypsin进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为4T1乳腺癌细胞悬液，4T1乳腺癌细胞悬液中细胞浓度为1
×
10
7 个/mL。
[0024]使用异氟烷1.5剂量气麻Balb/c小鼠，剃毛，沿坐骨间隙开口，钝性分离筋膜。小心
用镊子挑出坐骨神经。把4T1肿瘤细胞悬液用200μL的移液枪吹匀10次左右，取5μL肿瘤细胞，滴于PE手套上。用注射器吸取肿瘤细胞，平行进入坐骨神经。打入细胞，并停留10s左右使液体在拔出注射器时不会随着漏出；缝合。
[0025]于注射第7d和14d，分别检测小鼠坐骨神经功能指数（SFI）和痛阈值；第15d麻醉小鼠，灌注后暴露坐骨神经取出长肿瘤的坐骨神经，测量肿瘤大小，长肿瘤的坐骨神经放置
‑
80℃冰箱或4%多聚甲醛中保存备用。
[0026]图2为肿瘤细胞注射15天后浸润神经生长结果。
[0027]（3）坐骨神经功能测定坐骨神经功能指数（SFI）检测：自制一长60cm、宽10cm、高10cm的两端开口木槽，将70g白纸裁成与木槽等长等宽后铺于槽底。大鼠双后肢用颜料浸于双踝关节着色后，将大鼠放于槽的一端，使其自行向槽的另一方行走，每侧后肢各留下5～6个足印。选择印迹清晰的足印分别测量正常足(N)和伤侧足(E)的3个指标：A、PL(足印长度)；B、TS(足趾宽度)；C、IT(中间足趾宽度)。将上述指数代入Bain公式，计算出坐骨神经功能指数。Bain公式：SFI=109.5(ETS
ꢀ‑ꢀ
NTS)/NTS
ꢀ‑ꢀ
38.3(EPL—NPL)/NPL+13.3(EIT—NIT)/NIT
ꢀ‑ꢀ
8.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌侵袭神经及诱发疼痛的动物模型，其特征在于：该动物模型是将4T1乳腺癌细胞于动物坐骨神经外膜下局部注射后得到。2.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于：所述动物为小鼠。3.权利要求1所述动物模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，麻醉Balb/c小鼠，剃毛，沿坐骨间隙开口，钝性分离筋膜，用镊子游离出坐骨神经；步骤2，吸取4T1乳腺癌细胞悬液，注射于坐骨神经外膜，注射后缝合。4.根据权利要求3所述的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈霞，吴坚，邢佳俊，张永辉，魏金环，陈罡，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：