一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗。本发明专利技术提供了一种预防冠状病毒引起疾病(COVID

【技术实现步骤摘要】
一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗。

技术介绍

[0002]2019新型冠状病毒(英文简写2019-nCoV)，其所致疾病命名为COVID-19。2020年3 月2日，在《自然》杂志子刊《微生物学》上，国际病毒分类学委员会冠状病毒研究小组， 将该病毒命名为SARS-CoV-2。该病毒现已引起世界大流行，急需可以诱导对其免疫保护的 疫苗用于疫情防控。
[0003]冠状病毒(Coronavirus)是自然界广泛存在的一类病毒，主要感染脊椎动物，感染人引 起传染病的冠状病毒除上述2019-nCoV外，还有引发重症急性呼吸综合症的SARS-CoV和引 发中东呼吸综合症的MERS-CoV。
[0004]已有的研究表明，SARS-CoV和MERS-CoV的正链RNA基因组编码的主要结构蛋白有 表面刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、外膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)等。S蛋白是病毒表 面三聚体糖蛋白，通过与细胞表面的受体结合，引导病毒进入宿主细胞，SARS-CoV和 MERS-CoV分别以人血管紧张素酶2(ACE2)和人二肽基肽酶(DPP4，又名CD26)作为主 要受体。S蛋白是I型膜蛋白，在特定条件下可以被宿主蛋白酶水解为S1和S2亚基，S1与 细胞表面受体结合，S2通过天然构象的改变，介导膜融合，使病毒基因组进入宿主细胞，完 成感染过程。
[0005]疫苗研究发现，S蛋白虽然具有较高的免疫原性，并可诱导机体产生针对SARS-CoV的 中和抗体，但是，以全长S蛋白作为抗原可诱发嗜酸细胞免疫病理学或抗体介导的免疫增强 ADE等不良反应，其安全性受到广泛质疑。SARS-CoV S蛋白RBD区作为独立的结构域，可 形成正确构象，并包含多个空间结构依赖的抗原表位，在动物模型中可诱导高滴度中和抗体、 CD8
+
T细胞反应以及长期免疫保护效果。
[0006]糖基化修饰途径改造的酵母菌株既保留了安全性高、工程株构建周期短、生长快、易于 大规模生产等特点，又具有糖基化修饰接近、甚至更优于抗原的天然糖基结构的能力，使其 非常适合于在突发传染病和其它应急条件下作为高效、大规模的疫苗生产的表达系统。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗。
[0008]本专利技术所要求保护的预防冠状病毒引起疾病的疫苗，含有冠状病毒S蛋白受体结合区的 糖蛋白、氢氧化铝佐剂和CpG佐剂。
[0009]其中，所述冠状病毒可为SARS-CoV-2；相应的，所述冠状病毒引起疾病为COVID-19。
[0010]所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白的氨基酸序列可为如下任一：
[0011](a1)SEQ ID No.21(RBD223)；
[0012](a2)SEQ ID No.22(RBD216)；
[0013](a3)SEQ ID No.23(RBD210)；
[0014](a4)将(a1)-(a3)中任一所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的序列，或与(a1)-(a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％ 以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的序列。
[0015]其中，SEQ ID No.21至SEQ ID No.23所示的3个氨基酸序列均为来源于GenBank号为 MN908947.3的SARS-CoV-2"Wuhan-Hu-1"分离株S蛋白的一部分。具体的，SEQ ID No.21 为S蛋白的R319-F541区域(RBD223)；SEQ ID No.22为S蛋白的R319-V534区域(RBD216)； SEQ ID No.23为S蛋白的R319-K528区域(RBD210)。
[0016]所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白为具有哺乳动物糖型结构N-糖链修饰的冠状 病毒S蛋白受体结合区糖蛋白。
[0017]进一步地，所述哺乳动物糖型结构N-糖链为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、 GalGlcNAcMan5GlcNAc2或Man5GlcNAc2。
[0018]所述CpG佐剂可为如下任一：
[0019](b1)核苷酸序列为SEQ ID No.27的CpG2006或其硫代产物；
[0020](b2)核苷酸序列为SEQ ID No.28的CpG-1018或其硫代产物；
[0021](b3)核苷酸序列为SEQ ID No.29的CpGX1或其硫代产物；
[0022](b4)核苷酸序列为SEQ ID No.30的CpG684或其硫代产物；
[0023]进一步地，所述硫代产物为全链硫代修饰产物(即每个碱基都经硫代修饰)。
[0024]所述CpG佐剂最优的是全链硫代修饰的CpG2006，次之为全链硫代修饰的CpG684、全 链硫代修饰的CpGX1或全链硫代修饰的CpG1018。
[0025]在所述疫苗中，所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白、所述氢氧化铝佐剂(以铝含 量计)、所述CpG佐剂的质量比可为(2.5～20)：100：(25～50)。
[0026]所述冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)的糖蛋白可以由哺乳动物细胞或昆虫细胞或酵 母等表达制备。
[0027]所述冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)的糖蛋白可按照如下步骤的方法制备得到：
[0028](1)在经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母中表达所述冠状病毒S蛋白受 体结合区(RBD)，得到重组酵母细胞；
[0029]所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母为甘露糖基化修饰途径缺陷、并重 构了哺乳动物细胞N-糖基化修饰途径的巴斯德毕赤酵母细胞突变体；
[0030](2)培养所述重组酵母细胞，从培养上清中纯化获得具有哺乳动物糖型结构N-糖链修 饰的冠状病毒S蛋白受体结合区，即为所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白。
[0031]其中，所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母可按照包括如下步骤的方法 制备得到：
[0032](A1)失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸 甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶 IV，得到重组酵母1；
[0033](A2)在所述重组酵母1中表达如下外源蛋白中的至少一种：外源甘露糖苷酶I、外源 N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖 异构酶和外源半乳糖转移酶，得到重组酵母2；所述重组酵母2即为所述经过糖基化修饰
途 径遗传改造的巴斯德毕赤酵母。
[0034]在步骤(A2)之后还可包括如下步骤(A3)：
[0035](A3)失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，得到重组酵母3；所述重组酵母 3也为所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗，含有冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白、氢氧化铝佐剂和CpG佐剂。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述冠状病毒为SARS-CoV-2；和/或所述冠状病毒引起疾病为COVID-19。3.根据权利要求1和2所述的疫苗，其特征在于：所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白的氨基酸序列为如下任一：(a1)SEQ ID No.21；(a2)SEQ ID No.22；(a3)SEQ ID No.23；(a4)将(a1)-(a3)中任一所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列，或与(a1)-(a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的序列；和/或所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白为具有哺乳动物糖型结构N-糖链修饰的冠状病毒S蛋白受体结合区糖蛋白；进一步地，所述哺乳动物糖型结构N-糖链为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2或Man5GlcNAc2。4.根据权利要求1-3中任一所述的疫苗，其特征在于：所述CpG佐剂为如下任一：(b1)核苷酸序列为SEQ ID No.27的CpG2006或其硫代产物；(b2)核苷酸序列为SEQ ID No.28的CpG1018或其硫代产物；(b3)核苷酸序列为SEQ ID No.29的CpGX1或其硫代产物；(b4)核苷酸序列为SEQ ID No.30的CpG684或其硫代产物；进一步地，所述硫代产物为全链硫代修饰产物。5.根据权利要求1-4中任一所述的疫苗，其特征在于：所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白、所述氢氧化铝佐剂、所述CpG佐剂的质量比为(2.5～20)：100：(25～50)；所述氢氧化铝佐剂的量以其中铝的含量计。6.根据权利要求1-5中任一所述的疫苗，其特征在于：所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白是按照如下步骤的方法制备得到的：(1)在经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母中表达所述冠状病毒S蛋白受体结合区，得到重组酵母细胞；所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母为甘露糖基化修饰途径缺陷、并重构了哺乳动物细胞N-糖基化修饰途径的巴斯德毕赤酵母细胞突变体；(2)培养所述重组酵母细胞，从培养上清中纯化获得具有哺乳动物糖型结构N-糖链修饰的冠状病毒S蛋白受体结合区，即为所述冠状病毒S蛋白受体结合区的糖蛋白；和/或所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母是按照包括如下步骤的方法制备得到的：(A1)失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶
IV，得到重组酵母1；(A2)在所述重组酵母1中表达如下外源蛋白中的至少一种：外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶和外源半乳糖转移酶，得到重组酵母2；所述重组酵母2即为所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母；和/或在步骤(A2)之后还包括如下步骤(A3)：(A3)失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，得到重组酵母3；所述重组酵母3也为所述经过糖基化修饰途径遗传改造的巴斯德毕赤酵母；和/或当所述哺乳动物糖型结构N-糖链为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2或Man5GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源半乳糖异构酶和外源半乳糖转移酶、外源甘露糖苷酶II，以及外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II；或当所述哺乳动物糖型结构N-糖链为GalGlcNAcMan5GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I，以及外源半乳糖异构酶和外源半乳糖转移酶；或当所述哺乳动物糖型结构N-糖链为Man5GlcNAc2时，步骤(A2)中在所述重组酵母1中表达的外源蛋白为外源甘露糖苷酶I；和/或步骤(A1)中，所述失活受体巴斯德毕赤酵母内源的α-1,6-甘露糖转移酶、磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶I、β甘露糖转移酶II、β甘露糖转移酶III和β甘露糖转移酶IV均是采用同源重组的方式进行基因敲除；和/或步骤(A2)中，在所述重组酵母1中表达所述外源蛋白是通过向所述重组酵母1中导入所述外源蛋白的编码基因实现的；进一步地，所述外源蛋白的编码基因是以重组载体的形式导入所述重组酵母1中的；或进一步地，所述外源甘露糖苷酶I的编码基因和所述外源甘露糖苷酶II的编码基因均向所述重组酵母1中导入两次；和/或步骤(A3)中，失活所述重组酵母2内源的O甘露糖转移酶I，是通过对所述重组酵母2的基因组DNA中的O甘露糖转移酶I编码基因进行插入失活实现的。和/或所述外源甘露糖苷酶I来源于绿色木霉，且C端融合内质网保留信号HDEL；和/或所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I来源于哺乳动物，在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号；进一步地，所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I来源于人，且含有mnn9定位信号；和/或
所述外源甘露糖苷酶II来源于丝状真菌、植物、昆虫、爪哇或哺乳动物，在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号；和/或所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II来源于哺乳动物，在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号；进一步地，所述外源甘露糖苷酶II来源于线虫，和/或所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II来源于人，且均含有mnn2定位信号；和/或所述外源半乳糖异构酶和所述外源半乳糖转移酶均来源于哺乳动物，在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号；进一步地，所述外源半乳糖异构酶和所述外源半乳糖转移酶为融合蛋白，均来源于人，且共用一个kre2定位信号；和/或所述α-1,6-甘露糖转移酶为如下B1)或B2)：B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述磷酸甘露糖转移酶为如下B3)或B4)：B3)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；B4)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述磷酸甘露糖合成酶为如下B5)或B6)：B5)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；B6)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述β甘露糖转移酶I为如下B7)或B8)：B7)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；B8)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述β甘露糖转移酶II为如下B9)或B10)：B9)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
B10)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或与SEQ ID No.5所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；和/或所述β甘露糖转移酶III为如下B11)或B12)：B11)氨基酸序列是SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，吴军，孙鹏，王甜甜，巩新，侯旭宸，徐俊杰，殷瑛，张军，罗士强，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：