一种核糖体σ因子B及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种核糖体σ因子B及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用。该核糖体σ因子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。本申请筛选得到的核糖体σ因子B及其突变体过表达均能提高利普司他汀的产量。达均能提高利普司他汀的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种核糖体
σ
因子B及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用
[0001]本申请是申请日为2020
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10
‑
29，申请号为202011176931.9，专利名称为“一种核糖体σ因子及其突变体和编码得到的蛋白在提升利普司他汀产量中的应用”的分案申请。


[0002]本专利技术属于微生物基因工程
，具体涉及一种核糖体σ因子及其突变体在提升利普司他汀产量中的应用。

技术介绍

[0003]利普司他汀的四氢衍生物
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奥利司他作为目前通过美国FDA、欧盟EMA和中国SFDA认证的不抑制食欲，不作用于中枢神经系统的肥胖症治疗药物，全球超过4千万人服用并成功减重，是目前最畅销的减肥产品。作为长效的特异性胰脂肪酶抑制剂，能阻止甘油三酯水解为可被小肠粘膜吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油，从而减少热量摄入，控制体重。而利普司他汀最初是从链霉菌Streptomyces toxytricini中分离得到，具有β
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丙内酯结构单元，其2，3位分别被6碳烷基烃链和13碳烷基烃链所取代，13碳烷基烃链C5位上的羟基则和N
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甲酸基
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L
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亮氨酸形成酯键。由于利普司他汀分子结构复杂，化学合成工艺复杂，需消耗大量的人力与物力。目前利普司他汀的生产主要采用半生物发酵工艺，相比化学方法减少了有毒溶媒的使用，大大减少了对环境造成污染，以及毒性物质残留。
[0004]目前，国内外对利普司他汀产生菌合成利普司他汀的研究主要采用单因素试验和正交设计实验相结合的方法，优化发酵培养基和发酵参数，如添加生物素和ATP对脂类和利普司他汀合成的影响(董惠钧等，添加生物素和ATP对毒三链霉菌脂类和利普司他汀合成的影响，中国医药工业杂志，2014，01期，第19
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24页)。
[0005]核糖体σ转录因子是RNA聚合酶的重要组成部分，在原核生物的转录过程中发挥重要的作用。如在Streptomyces avermitilis中过表达frr会增加阿维菌素的产量(Li L et al,(2010)Over expression of ribosome recycling factor causes increased production of avermectin in Streptomyces avermitilis strains.J Ind Microbiol Biotechnol 37(7):673
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679)，但目前影响利普司他汀合成的核糖体σ转录因子未见报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种核糖体σ因子及其突变体和编码得到的蛋白在提升利普司他汀产量中的应用，本专利技术通过基因组测序及生物信息学分析对其核糖体因子进行比较分析，发现15个不同的核糖体因子，后通过评价，发现在Streptomyces toxytricini中过表达核糖体σ转录因子A和B能提高利普司他汀的产量，并提供两个核糖体σ转录因子A和B的突变体，及其在利普司他汀生产中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008]一种核糖体σ因子在提升利普司他汀产量中的应用，该核糖体σ因子为核糖体σ因
子A或核糖体σ因子B。
[0009]进一步地，核糖体σ因子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]进一步地，核糖体σ因子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011]一种如上述所述的核糖体σ因子A的突变体，该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]进一步地，核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，与正常的核糖体σ因子A氨基酸序列相比，其第19位氨基酸替换为R，第327位氨基酸替换为G，第338位氨基酸替换为G，第344位氨基酸替换为F，第347位氨基酸替换为S，第538位氨基酸替换为T。
[0013]一种如上述所述的核糖体σ因子B的突变体，该突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]进一步地，核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，与正常的核糖体σ因子B氨基酸序列相比，其第95位氨基酸替换为T，第274位氨基酸替换为S，第275位氨基酸替换为T，第351位氨基酸替换为V，第411位氨基酸替换为D。
[0015]上述核糖体σ因子A的突变体或其编码的蛋白质在提升利普司他汀产量中的应用。
[0016]上述的核糖体σ因子B的突变体或其编码的蛋白质在提升利普司他汀产量中的应用。
[0017]一种质粒，包括上述核糖体σ因子、核糖体σ因子A的突变体，或核糖体σ因子B的突变体。
[0018]一种转基因细胞系，包括上述核糖体σ因子、核糖体σ因子A的突变体，或核糖体σ因子B的突变体。
[0019]一种工程菌，包括上述核糖体σ因子、核糖体σ因子A的突变体，或核糖体σ因子B的突变体。
[0020]进一步地，通过将含有所述编码基因的表达载体导入链霉菌Streptomyces toxytricini中进行过表达。
[0021]进一步地，该基因或突变基因位于质粒或染色体中。
[0022]本专利技术的有益效果为：
[0023]通过对10个核糖体因子的筛选研究，表明其中核糖体σ因子A和B及其突变体基因在链霉菌Streptomyces toxytricini过表达，不仅对基因工程菌生物安全(在菌内过表达未对菌体的生长造成影响)，同时可以有效的提高链霉菌Streptomyces toxytricini生产利普司他汀的能力。实验数据表明其中对于原始基因在Streptomyces toxytricini过表达提高产利普司他汀的能力，尤其是它们的突变体基因过表达能更进一步提高产利普司他汀的能力。
附图说明
[0024]图1为质粒载体pKC1139
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liprA的图谱、
[0025]图2为质粒载体pKC1139
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liprB的图谱、
[0026]图3为质粒载体pKC1139
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liprA
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mut的图谱、
[0027]图4为质粒载体pKC1139
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liprB
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mut的图谱、
[0028]图5为利普司他汀浓度标准曲线。
具体实施方式
[0029]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核糖体σ因子B在提升利普司他汀产量中的应用，其特征在于，所述核糖体σ因子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.一种如权利要求1中所述的核糖体σ因子B的突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列为由如SEQ ID NO.6所示的序列，经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，具体序列如SEQ ID NO.3所示；所述核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄胜雄，颜一军，刘兴勇，马小燕，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，
类型：发明
国别省市：