用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学检测领域，公开了一种用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物、试剂盒和检测方法。该组合物包括：用于检测霍乱弧菌O1群的引物对1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，特别涉及用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]霍乱(Cholera)是一个古老的烈性肠道传染病，被称为“摧毁地球最可怕的瘟疫之一”。其临床表现为急性腹泻、呕吐，泻吐频繁、量大，为米泔水样，从而导致脱水、电解质紊乱及周围循环衰竭，严重者可致休克、酸中毒，如不及时抢救，病死率甚高。轻症患者有时类似肠炎，易于漏诊或误诊，其危害性同样不可忽视。革兰氏阴性菌
‑
霍乱弧菌(Vibrio cholerae，VC)是引起霍乱的病原菌。
[0003]霍乱弧菌在分类上为弧菌科弧菌属。根据菌体(O)抗原不同，可将霍乱弧菌分成若干O血清群。目前已分出200个以上的O血清群(O serogroups)，但仅发现O1群和O139群霍乱弧菌能引发霍乱，对于O1群和O139群以外的血清群被统称为非O1/O139群。
[0004]由于霍乱通常来势迅猛，通过水源可迅速传播等特点，易引起世界大流行，被确定为国际检疫传染病。我国在传染病防治法中规定霍乱属于甲类传染病，必须重点监测和检疫。因此，需要建立一种能应用于现场甚至野外的霍乱弧菌致病血清群(O1群和O139群)的核酸检测方法，这对于病原检出和提高疫情应对能力具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物、试剂盒和检测方法。所述检测方法的特异性好，灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，能够满足现场和野外环境下对于霍乱弧菌的检测需要。
[0006]本专利技术提供了一种用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物，包括：
[0007]用于检测霍乱弧菌O1群的引物对1，其核苷酸序列为：
[0008]正向引物：5
’‑
CATTCACTTATGTTGCCTCGGT
‑3’
(SEQ ID NO：1)，
[0009]反向引物：5
’‑
GACTCACCTTCGATTTCAGCA
‑3’
(SEQ ID NO：2)；
[0010]以及，用于检测霍乱弧菌O139群的引物对2，其核苷酸序列为：
[0011]正向引物：5
’‑
GTTCCCTTGTTAGACCACCG
‑3’
(SEQ ID NO：3)，
[0012]反向引物：5
’‑
CCTTTCCACCTCGGTATTTCA
‑3’
(SEQ ID NO：4)。
[0013]采用上述用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物对待测物进行检测，可实现对霍乱弧菌O1群和霍乱弧菌O139群的同时检测，以区别其致病的具体霍乱弧菌血清群。
[0014]优选的，所述组合物还包括：
[0015]用于检测霍乱弧菌O1群的探针A，其核苷酸序列为：5
’‑
AATACCATAGTCCAGTGTG
‑3’
(SEQ ID NO：5)；
[0016]以及，用于检测霍乱弧菌O139群的探针B，其核苷酸序列为：5
’‑
TGCTGAGTTTGCTGCCAGTT
‑3’
(SEQ ID NO：6)。
[0017]更优选的，所述探针A和所述探针B的5
’
端均标记有荧光基团，所述探针A和所述探针B的3
’
端均标记有淬灭基团；且所述探针A和所述探针B所标记的荧光基团不相同。
[0018]其中，所述荧光基团包括但不限于以下类型：FAM、CY5、TEXAS RED、Tet、HEX；所述淬灭基团包括但不限于以下类型：BHQ1、BHQ2、TAMRA、ECLIPSE、MGB。
[0019]进一步优选的，所述探针A所标记的荧光基团为FAM，所述探针B所标记的荧光基团为HEX。所述探针A和探针B所标记的淬灭基团均为MGB。
[0020]本专利技术还提供了一种用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的试剂盒，包括上述的组合物。
[0021]优选的，所述试剂盒还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、甲酰胺、硫酸铵、海藻糖和Taq DNA聚合酶，所述四种核苷酸为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。
[0022]更优选的，所述阴性质控物为TE缓冲液或超纯水。所述TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成，配置用水为无核糖核酸酶的超纯水。
[0023]更优选的，所述阳性质控物为含有如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的pGEM
‑
T载体质粒。所述如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列中包括霍乱弧菌O1群和O139群的特异性保守序列。
[0024]TGTACCAACATTCACTTATGTTGCCTCGGTTAATACCATAGTCCAGTGTGGTGCGTTACCCGTTTTTGCTGAAATCGAAGGTGAGTCTCTACAAGTGAGCTTCATTAGAAGGGCGGGTTCCCTTGTTAGACCACCGCATTGCTGAGTTTGCTGCCAGTTTGCCGATCCATTTGAAATACCGAGGTGGAAAGGGAAAGTGG(SEQ ID NO.7)。
[0025]本专利技术还提供了一种霍乱弧菌O1群和O139群的检测方法，包括以下步骤：
[0026]提取待测样品的DNA，采用上述试剂盒对所述DNA进行检测。
[0027]具体的，提取待测样品的DNA，在热对流PCR管中加入所述DNA，采用上述试剂盒和热对流PCR检测设备进行检测。
[0028]本专利技术采用恒温热隔绝式PCR(iiPCR)的方法对霍乱弧菌进行检测，恒温热隔绝式PCR(insulated isothermal PCR，iiPCR)亦称为热对流PCR，是由Krishnan M等人于2002年建立的一种新型简易PCR扩增技术发展起来。iiPCR利用了溶液的热对流原理，即当针对装有液体的容器底部加热时，由于上方表面较冷的液体比重较高，因此会因为重力向下移动；下方受热的液体则因为比重较低，因此会被挤到向上移动，因此会自然形成液体的循环。当较热的液体流动至表面时，又会因为环境的散热而变冷，较冷的液体流动至底部时又会因为受热而变热，所以这种循环可以一直持续下去，从而形成了稳定的温度梯度。如果对受热容器的形状和材质进行特殊设计，找到最适的管径与高度，如市场上的下细上粗的“R
‑
Tube”PCR管，能巧妙的控制对流的时间与散热的速率，就可以形成适合PCR的变性
‑
退火
‑
延伸等反应的局部环境。
[0029]优选的，在所述热对流PCR管中，每条引物的终浓度均为0.3
‑
0.8μmol/L，每条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物，其特征在于，包括：用于检测霍乱弧菌O1群的引物对1，其核苷酸序列为：正向引物：5
’‑
CATTCACTTATGTTGCCTCGGT
‑3’
，反向引物：5
’‑
GACTCACCTTCGATTTCAGCA
‑3’
；以及，用于检测霍乱弧菌O139群的引物对2，其核苷酸序列为：正向引物：5
’‑
GTTCCCTTGTTAGACCACCG
‑3’
，反向引物：5
’‑
CCTTTCCACCTCGGTATTTCA
‑3’
。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括：用于检测霍乱弧菌O1群的探针A，其核苷酸序列为：5
’‑
AATACCATAGTCCAGTGTG
‑3’
；以及，用于检测霍乱弧菌O139群的探针B，其核苷酸序列为：5
’‑
TGCTGAGTTTGCTGCCAGTT
‑3’
。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述探针A和所述探针B的5
’
端均标记有荧光基团，所述探针A和所述探针B的3
’
端均标记有淬灭基团；且所述探针A和所述探...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄慧娜，陈新彬，莫秋华，李艳华，涂承宁，汪海波，成子栋，周小坚，
申请(专利权)人：珠海国际旅行卫生保健中心拱北海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：