用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针，其针对ABO双倍体基因型相关的3个核酸多态性位点，设计适合用于上述位点检测的三种特异性Taqman水解探针，同时结合专门设计的引物组，通过优化扩增反应条件，获得一套完整的用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针实时荧光定量PCR检测方法，其具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，能够用于基因组DNA或外周血网织红细胞mRNA的ABO嵌合体检测。检测。

【技术实现步骤摘要】
用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法。

技术介绍

[0002]异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo
‑
HSCT)是用健康的供者造血细胞替代受者自身来重建造血及免疫功能以达到治疗疾病的目的。allo
‑
HSCT 术后受者必然出现自身及供者来源造血共存即嵌合体现象（chimerism），嵌合体状态可伴随移植进展呈动态性变化或稳定存在。当前allo
‑
HSCT嵌合体分析具有重要的临床诊疗价值，如：移植物植入监控、移植排斥早期诊断、微小残留病或早期复发诊断等，也是实施调整 GVHD 免疫抑制强度、供者淋巴细胞输注等干预措施的重要依据。
[0003]当前国内外主流的基因水平嵌合体分析方法为短片段重复序列 PCR（short tandem repeats，STR
‑
PCR）和基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）的实时荧光定量PCR，但STR
‑
PCR存在1%～5%的低灵敏度、有时存在切迹峰干扰其准确定量的缺陷；而依赖SNP实时荧光定量 PCR 灵敏度尽管可达 10
‑1~10
‑4，但因 SNP更低的信息效力将导致其筛选规模较STR明显扩大。最关键的是，这两种方法实施前提均需要首先确定具有区分供受者的遗传标志物作为靶点，其具体的策略是依据群体分布频率高低来组成相应规模的候选标志物谱，并从中随机筛选加以确定，因而具有区分供受者效力的靶点在实际筛选中存在较大的盲目性、不确定性和种群间的不通用性。
[0004]目前ABO血型不合的造血干细胞移植在临床上比较常见，约占移植总体的40～50%。而ABO血型不合的造血干细胞移植术后天然存在供受者两种不同ABO血型血细胞的共存时期，即天然存在ABO嵌合体。考虑到ABO基因特征性的核酸多态性位点（nucleotide polymorphism sites, NPs）主要为 SNP 或插入缺失多态性，因而完全符合基因水平嵌合体分析的靶点要求。更重要的是，除了极罕见基因表达障碍外，ABO 不合 HSCT 供受者 ABO 表型及其基因型均存在固有的差异，也即提示天然存在可区分供受者的ABO基因型特征性NPs，这决定了其作为嵌合体分析的靶点将更直接和具有可利用性，且拥有极低筛选规模及成本优势。动态监测ABO嵌合体比例及其转变不但反映ABO血型不合移植的供受者血细胞转变的实时状态及进程，而且是确保移植后全过程输血支持治疗的重要实验室依据。
[0005]目前已建立了ABO双倍体基因型相关的5个核酸多态性位点（NPs），即216突变位点、261正常位点、467突变位点、803正常位点和803突变位点，所采用的检测方法为采用SYBR
‑
green1染料的实时荧光 PCR 检测体系。随着Taqman 水解探针实时荧光定量PCR的出现，研究发现该方法比采用SYBR
‑
green1染料的实时荧光 PCR更有应用优势，从方法原理上比较，Taqman水解探针的特异性比SYBR
‑
green1染料更好，因为SYBR
‑
green1染料不只针对特异扩增的模板，对于引物非特异性的扩增产物也会导致荧光信号产生，而Taqman水解探针是与待检测的扩增模板特异性结合并在PCR延伸过程中才会产生荧光信号。但是目前仍
缺少适合ABO嵌合体基因水平检测的Taqman水解探针，而且缺少一套完整的用于ABO嵌合体的Taqman 水解探针实时荧光定量PCR检测方法。

技术实现思路

[0006]针对上述不足，本专利技术的目的在于提供了一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法，提高基因水平ABO嵌合体检测的灵敏性、准确性。
[0007]本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman 水解探针，包括三种TaqMan水解探针，它们分别为：探针261：FAM
‑
TCAACATCGACATCCTCAACGAGCA
‑
BHQ（序列表的序列1）；探针467：FAM
‑
CGCGGTGCCCCGCGTGA
‑
BHQ（序列表的序列2）；探针803：FAM
‑
GGGATGTAGGCCTGGGACTGGGGCCGGC
‑
BHQ（序列表的序列3）。
[0008]一种用于基因水平ABO嵌合体的检测方法，其具体包括以下步骤：（1）内参白蛋白基因标准曲线的建立：取一份高质量的基因组DNA作为标准品，用分光光度计重复测定基因组DNA的浓度8次，然后计算得到基因组DNA的浓度平均值， 再使用TE缓冲液进行稀释并调整得到浓度为100ng/
µ
L的DNA溶液，接着使用TE缓冲液对所述DNA溶液进行倍比梯度稀释，得到浓度依次为50ng/
µ
L、25ng/
µ
L、12.5ng/
µ
L、6.25ng/
µ
L、3.125ng/
µ
L、1.5625ng/
µ
L的稀释液；将各个稀释浓度的基因组DNA溶液分别作为DNA模板进行白蛋白内参基因PCR扩增反应，所述白蛋白内参基因PCR扩增反应的体系总体积为20
µ
L，其具体包括2
×
Hieff
TM qPCR Green Master Mix试剂盒的反应mix液10
µ
L、DNA模板2.0
µ
L、白蛋白上游引物0.8
µ
L、白蛋白下游引物0.8
µ
L，余量为无菌双蒸水；所述白蛋白上游引物和白蛋白下游引物的浓度均为10
µ
M；所述白蛋白上游引物为TGTTGCATGAGAAAACGCCA（序列表的序列4）；所述白蛋白下游引物为GTCGCCTGTTCACCAAGGAT（序列表的序列5）；所述内参基因PCR扩增反应的程序参数为：S1.95℃预变性 5min；S2.扩增循环参数：95℃ 10s，60℃ 30s，75℃ 1s，共40个循环；S3.熔解曲线分析参数：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，检测范围60℃～95℃，温度变化率为0.1℃/s；根据测定结果绘制白蛋白基因的扩增曲线、熔解曲线和标准回归曲线；（2）取待测血样进行DNA的提取，具体是先取血样2mL于EDTA抗凝管中得到EDTA抗凝血，然后取EDTA抗凝血100μL于EP管中，接着加入100 μLNaI，涡旋振荡2~3 min，接着加入200 μL抽提剂抽提3 min，再在13000 r/min的条件下离心本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针，其特征在于：包括三种TaqMan水解探针，它们分别为：探针261：FAM
‑
TCAACATCGACATCCTCAACGAGCA
‑
BHQ；探针467：FAM
‑
CGCGGTGCCCCGCGTGA
‑
BHQ；探针803：FAM
‑
GGGATGTAGGCCTGGGACTGGGGCCGGC
‑
BHQ。2.一种用于基因水平ABO嵌合体的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：（1）内参白蛋白基因标准曲线的建立：取一份高质量的基因组DNA作为标准品，用分光光度计重复测定基因组DNA的浓度8次，然后计算得到基因组DNA的浓度平均值， 再使用TE缓冲液进行稀释并调整得到浓度为100ng/
µ
L的DNA溶液，接着使用TE缓冲液对所述DNA溶液进行倍比梯度稀释，得到浓度依次为50ng/
µ
L、25ng/
µ
L、12.5ng/
µ
L、6.25ng/
µ
L、3.125ng/
µ
L、1.5625ng/
µ
L的稀释液；将各个稀释浓度的基因组DNA溶液分别作为DNA模板进行白蛋白内参基因PCR扩增反应，所述白蛋白内参基因PCR扩增反应的体系总体积为20
µ
L，其具体包括2
×
Hieff
TM qPCR Green Master Mix试剂盒的反应mix液10
µ
L、DNA模板2.0
µ
L、白蛋白上游引物0.8
µ
L、白蛋白下游引物0.8
µ
L，余量为无菌双蒸水；所述白蛋白上游引物和白蛋白下游引物的浓度均为10
µ
M；所述白蛋白上游引物为TGTTGCATGAGAAAACGCCA；所述白蛋白下游引物为GTCGCCTGTTCACCAAGGAT；所述内参基因PCR扩增反应的程序参数为：S1.95℃预变性 5min；S2.扩增循环参数：95℃ 10s，60℃ 30s，75℃ 1s，共40个循环；S3.熔解曲线分析参数：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，检测范围60℃～95℃，温度变化率为0.1℃/s；根据测定结果绘制白蛋白基因的扩增曲线、熔解曲线和标准回归曲线；（2）取待测血样进行DNA的提取，具体是先取血样2mL于EDTA抗凝管中得到EDTA抗凝血，然后取EDTA抗凝血100μL于EP管中，接着加入100 μLNaI，涡旋振荡2~3 min，接着加入200 μL抽提剂抽提3 min，再在13000 r/min的条件下离心5 min，取上清液至新的EP管中，再加入200 μL异丙醇摇匀，然后在13000 r/min的条件下离心5 min，接着弃上清液，加入1mL体积浓度为70%的乙醇，在13000 r/min的条件下离心5 min，再弃上清液得到沉淀，然后将沉淀干燥后再加入20μL的灭菌双蒸水溶解得到待测DNA；所述抽提剂是氯仿和异戊醇按照体积比24:1的比例均匀混合得到的；（3）取5μL待测DNA用灭菌双蒸水稀释至1.0 mL得到待测样品，测定待测样品在260nm、280nm和310n m处的吸光度OD值，计算每个待测样品的浓度，将待测样品作为DNA模板，按照步骤（1）中所述的白蛋白内参基因PCR扩增反应进行扩增，根据所得到的扩增曲线和步骤（1）中得到的标准回归曲线分析计算得到待测样品的浓度，以此对待测样品的浓度进行校正，然后调节待测样品中DNA的浓度至20ng/μL；（4）PCR扩增反应：将步骤（2）中得到的待测样品分别作为检测模板进行PCR扩增反应，先将引物组261、引物组467、引物组803和三个水解TaqMan探针分别用双蒸水稀释成10pmol/μL的溶液，然后与检测模板、2
×
Probe PCR Master Mix试剂和灭菌双蒸水混合得
到用于检测261突变位点、261正常位点、467突变位点、803突变位点、803正常位点的扩增反应体系溶液；每个待测样品重复检测2次；所述引物组261由以下引物组成：上游引物261
‑
mut：GG...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘峰，
申请(专利权)人：广西医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：