新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及免疫分析检测技术领域，公开了一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：ACE2蛋白磁珠、新型冠状病毒S1蛋白RBD结构域

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫分析检测
，具体为一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]新冠肺炎(COVID
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19)是由新型冠状病毒(SARS
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COV
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2)感染导致的一种传染性疾病。该疾病具有传染力强，病毒传播及变异速度快等特征。截止到2021年7月16日，全球新冠肺炎感染累积病例已达1.89亿，因感染导致死亡人数已达408万。新冠肺炎已成为一种严重威胁人类健康的重大传染性疾病。
[0003]目前对于新冠肺炎的临床治疗尚无有效的病毒特异性化学药物出现。大量的临床及真实世界研究结果表明疫苗是人类对抗新冠肺炎重症发生及死亡最有效的武器，另外新冠肺炎康复者血清对治疗新冠肺炎重症感染也具有一定的疗效。中和抗体是具有阻断病毒感染宿主细胞功能的一类抗体。新冠病毒特异性中和抗体主要通过与病毒刺突蛋白S1亚基(简称S1蛋白)内的受体结合区(receptor binding domain,简称RBD)上的某些位点结合而抑制RBD与宿主细胞表面的新冠病毒受体人血管紧张素转化酶2蛋白(ACE2)结合，从而抑制新冠病毒感染病毒宿主细胞。新冠病毒特异性中和抗体是目前唯一明确的保护相关性免疫反应，被认为在疫苗诱导的免疫保护和康复病人血浆过继治疗中发挥着重要的作用。而且病毒特异性中和抗体水平已经成为评价新冠疫苗免疫效果的重要指标。
[0004]目前，检测新冠病毒血清中和抗体的标准方法为新冠活病毒或假病毒感染病毒受体表达细胞滴定法，这两种方法检测灵敏度高、准确，但分别需要生物安全III和II级实验室进行实验，且检测时间要长达2
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3天，同时检测价格高。因此这两种检测方法无法应用于新冠疫苗对大规模人群接种后各地方疾控中心或医院对当地疫苗接种者体内血清病毒特异性中和抗体的滴度变化进行快速跟踪评价或对新冠感染康复者血清内的中和抗体进行大规模平行比较鉴定。
[0005]近期通过新冠肺炎感染者感染期血清样品进行研究的数据表明功能酶联免疫方法(功能ELISA)可以快速检测新冠肺炎感染者血清内新冠病毒特异性中和性抗体。该方法把新冠病毒受体蛋白ACE2固相于96孔板内，通过评价新冠肺炎感染者血清抑制游离RBD蛋白与固相ACE2蛋白结合的活性而检测血清样品中新冠病毒中和抗体的滴度。该方法可在几小时内完成新冠病毒中和抗体滴定，而且对于新冠肺炎感染康复血清样品及疫苗免疫后血清样品无需生物安全II级实验室及以上级别生物安全实验室操作。因此该方法相对于活病毒细胞病变检测法或假病毒报告基因检测法具有检测快速、方便的优势。以该技术为基础，金斯瑞公司生产出“SARS
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CoV
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2Surrogate Virus Neutralization Test Kit”新冠病毒中和抗体检测试剂盒。但是最新研究结果表明该试剂盒对于中和抗体滴度较低的新冠病毒感染早期的血清样品检测灵敏性方面仍有不足。在后续的研究中以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础发展出多种新冠病毒中和抗体检测技术。如以稳定表达ACE2的细胞系、荧光标记S1蛋白及流式细胞分析仪为检测系统的中和抗体检测方法；以固相有S蛋白三聚体
的luminex微球、荧光标记ACE2蛋白及荧光读板机为检测系统的中和抗体检测方法等。然而这些新的中和抗体检测方法与功能ELISA方法相比检测灵敏性并无显著的提高或没有数据表明可以提高检测灵敏性。因此发展一种高灵敏新冠病毒中和抗体检测方法及检测试剂盒具有重要检测价值和市场需求。除此之外，目前的功能ELISA检测方法的重组蛋白需求量大，导致检测成本较高，从而不具有性价比优势。

技术实现思路

[0006]针对目前检测新冠病毒血清中和抗体方法灵敏性不足以及目前功能ELISA检测方法对重组蛋白需求量大，导致检测成本较高，从而不具有性价比优势等问题，本专利技术提供了一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒及其检测方法。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0008]本专利技术新型冠状病毒中和抗体检测的基本原理：
[0009]以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础，以固相有ACE2蛋白的磁珠和RBD
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mFc为检测体系，利用新冠病毒中和抗体会阻断RBD
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mFc与ACE2磁珠结合的原理，再通过荧光物质标记动物抗鼠的IgG抗体与RBD
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mFc结合，从而可对与RBD
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mFc发生结合的ACE2磁珠进行荧光标记，最后通过流式细胞仪对磁珠荧光染色水平进行分析，根据待测样品中新冠病毒中和抗体活性与磁珠荧光染色水平负相关这一原理来确定待测样品中新冠病毒中和抗体的活性。
[0010]但是与目前其他以新冠病毒受体/配体结合阻断策略为基础所发展出的各类新冠病毒中和抗体检测技术不同，本专利专利技术人通过深入实验研究首次发现对于以固相的新冠病毒受体(ACE2)结合游离的配体(新冠病毒S1蛋白或是RBD蛋白)为体系的新冠病毒中和抗体检测技术(如功能ELISA中和抗体检测试剂盒)，其检测灵敏性与游离的配体浓度成负相关。并且专利技术人把该规律应用于新冠病毒中和抗体检测技术和试剂盒研发的设计中来，在本专利技术中通过以下两种策略的应用使中和抗体检测试验中的游离配体(RBD
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mFc)的终浓度极低，从而使本专利技术具有高水平的新冠病毒中和抗体检测敏感性。(1)在检测中使用少量的ACE2磁珠可使RBD
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mFc最优使用浓度降低，检测结果以流式细胞仪进行分析可保证对少量的ACE2磁珠进行有效定量分析；(2)在对磁珠荧光染色水平进行分析的时候使用磁珠荧光百分率分析方法代替磁珠平均荧光密度分析方法可进一步降低中和抗体检测中RBD
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mFc的最优使用浓度。如果以磁珠平均荧光密度分析法对中和抗体活性进行分析时，应以RBD
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mFc与绝大多数ACE2磁珠发生饱和结合的临界浓度为中和抗体检测中的RBD
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mFc终浓度；如果以磁珠荧光百分率分析方法对中和抗体活性进行分析时，应以RBD
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mFc可与绝大多数ACE2磁珠发生结合(>90％结合率)的临界浓度为中和抗体检测中的RBD
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mFc终浓度。因为RBD
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mFc可与绝大多数ACE2磁珠发生结合(>90％结合率)的临界浓度要远远小于RBD
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mFc与绝大多数ACE2磁珠发生饱和结合的临界浓度，所以本专利技术以磁珠荧光百分率分析方法对中和抗体活性进行分析可有效降低RBD
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mFc在中和抗体检测中的使用终浓度。
[0011]本专利技术提供一种新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，包括：ACE2蛋白磁珠、新型冠状病毒S1蛋白RBD结构域
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鼠IgG Fc片段融合蛋白、荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：ACE2蛋白磁珠、新型冠状病毒S1蛋白RBD结构域
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鼠IgG Fc片段融合蛋白、荧光物质标记的动物抗鼠IgG抗体、新型冠状病毒中和抗体阳性标准品、新型冠状病毒中和抗体阴性标准品、鼠IgG同型对照抗体、10x浓缩洗液和样品稀释液。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于，所述ACE2蛋白磁珠通过以下方法制备得到：将12.5μg固相有链霉亲和素的磁珠与375ng预生物素化的重组人ACE2蛋白在25μL 0.01M pH值为7.2
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7.4的磷酸盐缓冲液中室温下共孵育40min，在共孵育20min后吹吸重悬一次，共孵育后把固相有ACE2蛋白的链霉亲和素的磁珠转入一个新的容器中，置于2
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8℃，当磁珠完全沉降于底部后，吸弃上清，以100μL含质量体积百分比0.02％叠氮化钠的样品稀释液重悬磁珠沉淀，制备成ACE2蛋白磁珠。3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述新型冠状病毒S1蛋白RBD结构域
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鼠IgG Fc片段融合蛋白为新型冠状病毒刺突蛋白RBD结构域的C端与鼠IgG1 Fc片段进行融合表达的重组蛋白，生产于哺乳动物细胞，保存于蛋白/抗体储存液中，保存终浓度为10
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50μg/mL，使用终浓度为1.5
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6ng/mL；所述鼠IgG同型对照抗体的使用终浓度为1.5
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6ng/mL。4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述荧光物质标记的动物抗鼠IgG抗体保存于蛋白/抗体储存液中，保存终浓度为50
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500μg/mL；所述荧光物质标记动物抗鼠IgG抗体中的荧光物质包括荧光染料、荧光蛋白、荧光染料/荧光蛋白合成物及量子点；所述荧光物质标记动物抗鼠IgG抗体中的动物包括山羊、绵羊、牛、驴、兔、大鼠及羊驼。5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述新型冠状病毒中和抗体阳性标准品为人源或兔源抗新型冠状病毒IgG单克隆中和抗体；所述新型冠状病毒中和抗体阴性标准品为人IgG或兔IgG同型对照抗体。6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含质量体积百分比为0.1
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0.5％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH值为7.2
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7.4；所述10x浓缩洗液为含有质量体积百分比为1％的牛血清白蛋白、体积百分比为0.25％吐温的0.1M磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。7.根据权利要求2所述的新型冠状病毒中和抗体磁珠荧光检测试剂盒，其特征在于：所述固相有链霉亲和素的磁珠直径为1
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3μm；所述预生物素化的重组人ACE2蛋白为人ACE2的Gln18
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Ser740部分在其C端与AVI标签进行融合表达的重组蛋白，该蛋白在生物素连接酶的作用下被生物素标记，生产于哺乳动物细胞。8.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆来，要翔宇，吴长新，傅羽佳，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：