一种抗水痘-带状疱疹病毒的重组siRNAs及其生产方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗水痘

【技术实现步骤摘要】
一种抗水痘
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带状疱疹病毒的重组siRNAs及其生产方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种抗水痘
‑
带状疱疹病毒的重组siRNAs及其生产方法和应用。

技术介绍

[0002]水痘
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带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus，VZV)是一种广泛存在并且具有高度传染性的人α亚科
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疱疹病毒。初次感染VZV可导致水痘，人群普遍易感(感染率约为61％～100％)。该病毒可在背根神经节潜伏感染，持续终生。水痘在全世界造成了巨大的疾病负担，每年至少有1.4亿新发水痘病例、420万水痘严重并发症病例以及4200死亡病例。此外，近三分之一的VZV感染者在年老时会因潜伏于神经的VZV重新激活而引起带状疱疹，通常伴有剧烈的神经痛，即使治愈后还会发生后遗神经痛，严重影响患者的生活质量。水痘和带状疱疹还会在新生儿与免疫缺陷人群中导致严重的危及生命的并发症。当前，VZV防治方法仍存在重大挑战，尚无特效治疗药物，现有疫苗存在仍保留神经毒力的风险隐患和适用人群限制等问题。
[0003]RNAi(RNA interference)是指由RNA分子介导的基因抑制，RNAi在基因功能研究和疾病治疗方面都有广泛的应用，目前已有多种基于RNAi的药物获得FDA批准或进入临床试验。逐年增加的RNA类药物获批数量充分证明了RNA疗法的可行性，也说明了RNA疗法作为新一代治疗方案正在快速发展当中。
[0004]RNA类新药开发以及RNA的功能研究已经掣肘于RNA原料的获取。目前用于ncRNA研究的RNA试剂，主要采用化学或体外转录合成。这些合成方法生产的RNA，不仅价格昂贵，而且产率很低。因此，RNA疗法的开展，还需新兴生物技术的介入，以大大降低研究/医疗成本。利用重组tRNA支架在活细胞内生产表达小分子RNA已经应用于多个研究领域，取得了良好的发展。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种抗水痘
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带状疱疹病毒的重组siRNAs。本专利技术通过生物工程获得的重组siRNAs具有很好的生物学活性，并且能够显著抑制水痘
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带状疱疹病毒的复制。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种抗水痘
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带状疱疹病毒的重组siRNAs，其特征在于，所述重组siRNAs的序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。
[0007]另外，本专利技术还提供了一种上述抗水痘
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带状疱疹病毒的重组siRNAs的生产方法，其特征在于，包括：以水痘
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带状疱疹病毒(VZV)基因组不同开放阅读框(ORF)为靶点，设计小干扰RNA(siRNAs)，将设计的小干扰RNA(siRNAs)序列嵌合于tRNA支架，在大肠杆菌中重
组表达，所述小干扰RNA的序列为SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：30所示序列中的一种。
[0008]上述的生产方法，其特征在于，所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90％以上的序列，所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO：31所示。
[0009]上述的生产方法，其特征在于，重组siRNAs的前体序列为成熟序列部分被取代的hsa
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miR
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34a前体序列，所述重组siRNAs的前体序列相应的为SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：46所示序列中的一种。
[0010]上述的生产方法，其特征在于，所述生产方法的具体步骤包括：
[0011]步骤一、设计合成嵌合小干扰RNA序列的hsa
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miR
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34a前体引物；
[0012]步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将重组siRNAs的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；
[0013]步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；
[0014]步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标重组siRNAs。
[0015]进一步地，本专利技术提供了上述重组siRNAs在制备抗水痘
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带状疱疹病毒基因组DNA组装、复制、细胞融合和/或在细胞间传播的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
[0016]更进一步地，本专利技术提供了上述重组siRNAs在制备抗水痘
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带状疱疹病毒活性的前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
[0017]本专利技术以人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)为细胞模型，检测了重组siRNAs抗水痘
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带状疱疹病毒的抗病毒活性，包括：
[0018]一、利用表达的重组siRNAs在人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中进行转染，利用Stem loop qPCR技术检测重组siRNAs成熟体表达量；
[0019]二、将重组siRNAs在人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中进行转染并感染VZV病毒，利用qPCR技术检测重组siRNAs对靶基因的抑制情况；
[0020]三、将重组siRNAs在人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)中进行转染并感染VZV病毒，利用Western blot、免疫荧光(IF)、实验技术评价重组si
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ORF7、重组si
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ORF68对靶基因的抑制情况。
[0021]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0022]1、本专利技术利用tRNA支架表达的具有生物学活性的siRNAs相比于化学合成的siRNA，产量高，价格低廉，活性和安全性更高。
[0023]2、本专利技术的重组siRNAs具有很好的生物学活性，并且能够显著抑制水痘
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带状疱疹病毒的复制，且具有产量高、成本低、功能性好等优点。与传统的小分子药物相比，RNA药物可以直接作用于病毒的基因组，利用碱基互补配对原则来调节病毒mRNA表达，显著抑制病毒的复制和细胞间传播，降低病毒载量。
[0024]下面结合附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0025]图1为本专利技术实施例1利用引物PCR对含有重组siRNA(重组si
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ORF7、重组si
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ORF68)序列的插入片段扩增的凝胶电泳图。
[0026]图2为本专利技术实施例1pBSKrnaSeph/has
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mir
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34a表达载体双酶切鉴定的结果图。
[0027]图3为本专利技术实施例2利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组siRNA的
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗水痘
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带状疱疹病毒的重组siRNAs，其特征在于，所述重组siRNAs的序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15所示序列中的一种，或者为与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15所示序列中的一种相似度达90％以上的序列。2.一种如权利要求1所述重组siRNAs的生产方法，其特征在于，包括：以水痘
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带状疱疹病毒基因组不同开放阅读框为靶点，设计小干扰RNA，将设计的小干扰RNA序列嵌合于tRNA支架，在大肠杆菌中重组表达；所述小干扰RNA的序列为SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：30所示序列中的一种。3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90％以上的序列，所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO：31所示。4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，重组siRNAs的前体序列为成熟序列部分被取代的hsa
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miR
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34a前体序列，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：骞爱荣，田野，裴佳伟，李郁，陈志浩，杨超飞，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：