高灵敏度的免疫检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了高灵敏度的免疫检测方法及其应用，该免疫检测方法包括以下步骤：提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待测样本中的待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。该免疫检测方法在将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，可以达到更显著的级联放大效果，降低了检出限，提高了灵敏度。提高了灵敏度。提高了灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
高灵敏度的免疫检测方法及其应用


[0001]本申请涉及分子检测
，尤其是涉及高灵敏度的免疫检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]自上世纪60年代专利技术以来，免疫测试在实验和临床研究中发挥了很重要的作用。免疫分析几乎可以用于检测分析所有的生物分子，包括蛋白质、核酸、囊泡、小分子，甚至可以分析整个细胞。酶联免疫吸附分析(ELISA)从1971年第一次提出至今，已成为免疫学实验和临床研究最广泛使用的技术。ELISA基本原理和方法是将目标分子的特异性抗体固定到固体基质(微量反应板、微球、磁珠等)上，通过抗原抗体免疫吸附作用捕获目标分子，再连接酶标记的检测抗体用于催化后续检测反应产生颜色。通过酶促信号放大步骤，ELISA的检出限(LOD)可以达到0.01
‑
50ng/mL水平(pM
‑
nM)。凭借着酶促反应的信号放大，ELISA在常规诊断中发挥着很大的作用，然而，对于一些在人体中含量很低的生物标志物，例如跟癌症、心血管疾病、神经退行性疾病以及某些传染病早期诊断相关的生物标志物，ELISA就会暴露出其灵敏度不够的缺点，难以准确地检测出这些生物分子。另外，ELISA方法采用抗原抗体的特异性结合来识别捕获目标分子，再通过检测抗体的酶促反应来进行目标物的检测。但并非所有的抗体都适合进行酶标记。因此，有必要提供一种具有更高灵敏度的免疫检测方法。
[0003]规律间隔成簇短回文重复序列及其关联蛋白(CRISPR/Cas)体系是微生物在对抗外来病毒入侵的过程中形成的自适应免疫系统，该系统包含有可以编程的核酸内切酶，这使得CRISPR体系可以应用于疾病诊断领域。CRISPR体系在检测到目标DNA或RNA序列后，会将目标核酸分子附近的RNA或DNA序列剪切掉。根据这一原理，CRISPR体系在核酸检测中有着广泛的应用。而在免疫测定领域，虽然已有研究人员进行了初步探索，但检测的灵敏度仍然有待提高。

技术实现思路

[0004]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有更高高灵敏度的免疫检测方法。
[0005]本申请的目的还在于提供一种免疫检测试剂盒。
[0006]本申请的第一方面，提供免疫检测方法，该免疫检测方法包括以下步骤：
[0007]提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；
[0008]将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待测样本中的待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；
[0009]将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。
[0010]根据本申请实施例的免疫检测方法，至少具有如下有益效果：
[0011]本申请实施例所提供的免疫检测方法将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，利用捕获抗体捕获待测样本中的待检目标，再与标记核酸探针的检测抗体通过抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，以单独的液滴作为CRSIPR/Cas系统剪切反应的反应器，各个反应器相互隔离，以便后续对反应结果进行检测。通过这种方式，本申请实施例所提供的免疫检测方法可以达到更显著的级联放大效果，降低了待检目标的检出限，提高了检测灵敏度，有利于在临床中的应用。
[0012]其中，待检目标是指通过免疫检测方法检测待测样本时所需检测的目标物质，其非限制性实例包括生物大分子(如多肽、蛋白质)、细胞、微生物(如细菌、真菌、病毒)等。捕获抗体是指能够与待检目标发生抗原抗体特异性结合，从而将待检目标捕获的抗体。检测抗体是指同样能够与待检目标发生抗原抗体特异性结合，并通过标记的核酸探针进行检测的抗体。以此双抗夹心的反应方式得到待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体的免疫复合物。可以理解的是，捕获抗体与检测抗体针对于待检目标的不同表位，以避免发生竞争性结合。CRSIPR/Cas系统蛋白是指规律间隔成簇短回文重复序列及其关联蛋白，其非限制性实例包括二类
Ⅴ
型、
Ⅵ
型的CRISPR/Cas系统如Cas12(例如Cas12a～Cas12e)、Cas13(例如Cas13a～Cas13d)、Cas14(例如Cas14a～Cas14c)蛋白，这些蛋白不仅具有剪切特异靶标序列的顺式核酸酶活性，还有剪切非特异单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)的反式核酸酶活性。核酸探针是指包含CRSIPR/Cas系统蛋白对应的特异靶标序列的核酸分子。报告核酸是指在ssDNA或ssRNA上偶联有检测标记的核酸分子，能够通过CRSIPR/Cas系统蛋白的非特异性剪切而产生检测信号，其非限制性实例可以是在ssDNA或ssRNA上偶联荧光基团和淬灭基团，淬灭基团和荧光基团在报告核酸未发生非特异性剪切时距离较为接近，淬灭基团能够吸收荧光基团的荧光信号，从而抑制荧光基团产生荧光。而在报告核酸发生CRSIPR/Cas系统蛋白的非特异性剪切后，荧光基团和淬灭基团相互分离，荧光信号得以释放。
[0013]在本申请的一些实施方式中，液滴的体积为(1～100)
×
10
‑
15
L。通过将CRSIPR/Cas系统蛋白的剪切反应体系限制在飞升左右大小的液滴内，从而将检测标记的信号或检测标记经反应产生的信号进一步浓缩为可直接检测的信号，以进一步降低其检测限，极大地提高了反应的灵敏度。
[0014]在本申请的一些实施方式中，检测抗体偶联于微球，微球上标记有多个核酸探针。通过多个核酸探针的标记，达到级联放大的效果，进一步降低了待检目标的检出限。同时，将核酸探针标记到微球上以避免位阻效应而影响后续的检测。
[0015]在本申请的一些实施方式中，固态基质为磁性粒子。通过磁性粒子与捕获抗体形成偶联物作为探针去捕获待测样本中的待检目标，再和检测抗体与核酸探针的复合物通过检测抗体与待检目标的抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，达到隔离的目的，以便后续基于荧光液滴的检测。磁性粒子的非限制性实例包括磁珠、磁性微球等。
[0016]在本申请的一些实施方式中，CRSIPR/Cas系统蛋白为Cas13a蛋白。Cas13a具有特异性很强的RNA识别剪切能力，因而在选择RNA分子作为核酸探针时，选用Cas13a蛋白可以将反应体系的检测灵敏度降低至飞摩尔(fM)水平。
[0017]在本申请的一些实施方式中，液滴的封装方法包括以下步骤：提供油相、免疫复合
物与CRSIPR/Cas系统蛋白及报告核酸的混合液；以油相为流动相，以混合液为分散相，在压力和/或剪切力的作用下封装形成油包水的液滴。该封装方法利用油相的毛细作用剪切混合液，使得分散相被流动相所截断、形成将CRSIPR剪切体系封装在内的液滴。
[0018]在本申请的一些实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体偶联于固态基质，所述检测抗体标记有核酸探针；将所述待测样本、所述捕获抗体、所述检测抗体混合反应，使所述待测样本中的待检目标同时结合所述捕获抗体和所述检测抗体形成免疫复合物；将所述免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，所述CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切所述核酸探针，并诱导产生对所述报告核酸的非特异性剪切，根据所述报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。2.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述液滴的体积为(1～100)
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L。3.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述检测抗体偶联于微球，所述微球上标记有多个所述核酸探针。4.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述固态基质为磁性粒子。5.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述CRSIPR/Cas系统蛋白为Cas13a蛋白。6.根据权利要求1至5任一项所述的免疫检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴宇，徐晓建，牟磊，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：