肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，包括以下步骤：构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；所述目的基因为SOD1、TDP

【技术实现步骤摘要】
肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物
，具体涉及一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法。

技术介绍

[0002]肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)，在美国被称为卢伽雷(Lou Gehrig)症。著名物理学家斯蒂芬
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威廉
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霍金21岁时罹患此症，在轮椅上生活长达半个世纪。该病极为罕见，人群中发病比例约为十万分之一，发病机制是上下运动神经元损伤导致的肌肉失能。患者晚期因呼吸肌和膈膜损伤导致呼吸衰竭而死亡。遗传分析揭示，约10％表现家族聚集发病，其余为散发病例，且该病好发于45
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60岁的中老年人群。细胞水平研究表明，患者运动神经元内神经纤维聚集伴随线粒体功能异常，小胶质细胞被激活并促进星形胶质细胞活化，释放炎性因子和毒素。分子水平研究发现，运动神经元内自由基产生异常导致氧化压力升高，蛋白错误折叠和聚集加速，进而引发内质网应激反应。同时细胞膜上的谷氨酸转运体减少导致胞内的谷氨酸浓度上升，进而引起兴奋毒性。与此同时，细胞大量产生炎性因子，激活Caspase
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3引发细胞凋亡。
[0003]研究表明，ALS的常见致病基因包括SOD1、TDP
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43、FUS和C9orf72等，其中以SOD1(Superoxide Dismutase 1，超氧化物歧化酶)最为常见，是大约20％家族性ALS的致病基因。该基因编码一种超氧化物歧化酶，在神经元和胶质细胞中均广泛表达。现已发现上百种SOD1蛋白的突变体，均可导致SOD1蛋白折叠错误，在胞内产生大量聚集体。类似地，TDP
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43、FUS和C9orf72编码的蛋白错误折叠也会导致ALS的发生。
[0004]目前美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准上市用于治疗ALS的药物为两种小分子。利鲁唑片(英文名：Riluzole)为苯并噻唑类抗谷氨酸药物，可以通透血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)，抑制脑内神经递质(谷氨酸和天冬氨酸)的释放。依达拉奉(英文名：Radicava，edaravone)属于吡唑啉酮类化合物，可以清除胞内自由基，减轻氧化应激压力。利鲁唑只能延长患者生存周期约3个月，依达拉奉也只能改善患者的生活质量，无法根治此病。因此，有必要构建合适的ALS的细胞模型，模拟体内ALS的发病机制和运动神经元内SOD1存在和分布状态，为新药研发提供帮助。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，本专利技术还提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法制备的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，以解决现有肌萎缩侧索硬化细胞模型建模困难、影响因素繁多、造模效果差、成本高以及操作复杂等问题。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0007]构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段
和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；
[0008]制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；
[0009]所述目的基因为SOD1、TDP
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43、FUS和C9orf72中的任一种。
[0010]肌萎缩侧索硬化(ALS)的致病原理在于基因表达错误，具体基因类型有SOD1、TDP
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43、FUS和C9orf72等。本专利技术肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法通过构建表达错误基因的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，用于后续研究肌萎缩侧索硬化发病过程中错误表达蛋白的表达变化以及在细胞水平上筛选用于治疗肌萎缩侧索硬化病的的候选药物。本专利技术肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法包括两步，首先是构建含有目的基因片段的核心质粒，其次将该核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，由此获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株。本专利技术肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法能够构建长期稳定的ALS疾病细胞模型，可以反映多数家族遗传型ALS的发病机制，示踪SOD1蛋白在细胞内的表达和分布情况，还能用于筛选潜在的ALS疾病治疗药物。
[0011]优选的，所述核心质粒为慢病毒核心质粒，构建慢病毒核心质粒的具体步骤为：将酶切后的目的基因片段和慢病毒核心质粒载体连接后通过受体扩增，获得慢病毒核心质粒。
[0012]优选的，所述目的基因为SOD1，所述慢病毒核心质粒载体含有EGFP表达序列。
[0013]优选的，在制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株步骤中，取慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒混合于转染培养基中，将含有慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的转染培养基逐滴加入到293T感受态细胞培养液中并孵育，收集含有慢病毒的上清，再将含有慢病毒的上清与293T细胞孵育，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株。
[0014]优选的，所述慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的质量之比为3:2:1。
[0015]优选的，所述293T感受态细胞培养液采用以下方法制备：
[0016]将处于对数生长期的293T细胞用0.25％胰酶37℃消化30～300s后，然用完全培养基收集293T细胞，培养至细胞汇合度为60％～90％，再将293T细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育至细胞贴壁完全后，去除原有培养基并加入Opti
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MEM培养基，获得293T感受态细胞培养液。
[0017]优选的，所述肌萎缩侧索硬化细胞模型的构建方法还包括抗生素筛选稳定株的步骤，具体为：
[0018]将肌萎缩侧索硬化细胞模型的培养基去除并添加含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基，继续培养1～3周后的培养物为293T稳定株。
[0019]优选的，所述含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基中嘌呤霉素的浓度为1～10μg/mL。
[0020]本专利技术的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本专利技术实施例的实施而获知。
附图说明
[0021]为更清楚地阐述本专利技术的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说
明。
[0022]图1为实施例1提供的PCR产物电泳图；
[0023]图2为实施例1提供的酶切产物电泳图；
[0024]图3为实施例1提供的酶切产物电泳图；
[0025]图4为效果实施例中SOD1蛋白突变体和EGFP荧光蛋白的融合蛋白表达图；
[0026]图5为效果实施例中肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的荧光显微镜图；
[0027]图6为效果实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；所述目的基因为SOD1、TDP
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43、FUS和C9orf72中的任一种。2.如权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述核心质粒为慢病毒核心质粒，构建慢病毒核心质粒的具体步骤为：将酶切后的目的基因片段和慢病毒核心质粒载体连接后通过受体扩增，获得慢病毒核心质粒。3.如权利要求2所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述目的基因为SOD1，所述慢病毒核心质粒载体含有EGFP表达序列。4.如权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，在制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株步骤中，取慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒混合于转染培养基中，将含有慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的转染培养基逐滴加入到293T感受态细胞培养液中并孵育，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晗，李田忠，谢中建，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：