一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术旨在提供一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法，基于新分离得到的一株大口黑鲈虹彩病毒，将其灭活后与佐剂混合作为灭活疫苗，研究表明，所制备的灭活疫苗免疫效果好，相对免疫保护率最高可达100%，可广泛应用于大口黑鲈虹彩病毒感染的防控。泛应用于大口黑鲈虹彩病毒感染的防控。泛应用于大口黑鲈虹彩病毒感染的防控。

【技术实现步骤摘要】
一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法
[0001]
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗及其制备方法。
[0002]
技术介绍
：大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈、黑鲈，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、肉质鲜美、价格高和容易捕捞等众多优点而深受渔民的喜爱。20世纪70年代，大口黑鲈首次引入中国台湾，繁殖了十几代后，于 1983年引入广东省，在深圳、佛山、惠州一带进行人工养殖，佛山顺德地区是大口黑鲈的主要养殖区。因为大口黑鲈大口黑鲈的养殖在国内具有较好的经济效益，在近十几年内已迅速发展成为我国主要的经济养殖鱼种，并被认定为名优品种之一，具有重要的经济价值。大口黑鲈的产量在不断增多，根据中国《2018年中国渔业统计年鉴》分析得出，2017 年全国大口黑鲈养殖产量约为 46 万吨，相比于 2016年增长 31.57%，增长速度为淡水养殖鱼类之首。日渐增长的市场需求使得大口黑鲈的养殖规模逐渐变大，养殖密度也升高，与此同时，大口黑鲈在养殖过程中出现的病害概率也会增多，其中虹彩病毒病是大口黑鲈养殖中常见的病毒性疾病。大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV），该病毒最早于1991 年在美国佛罗里达州被发现，大口黑鲈感染该病毒后，通常症状不明显，或体表有出血、眼球突出。2008年至2010年初，顺德地区大口黑鲈养殖鱼塘大面积暴发疾病，造成重大经济损失。对濒死鱼剖检发现鱼鳔肿大，布满红色气腺。鱼鳔、肾脏研磨除菌后，接种鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）分离到致病性大口黑鲈虹彩病毒。
[0003]一般认为健康鱼感染大口黑鲈虹彩病毒主要是通过在水体里接触病原或者食入带病鱼饵，人工感染实验和孵化场还未发现垂直传播的病例。大口黑鲈虹彩病毒不仅可以导致大面积鱼暴发疾病死亡引起鱼灾，也可以是不表现任何症状的隐性带毒，这给疾病诊断带来困难。对该病的诊断必须综合流行情况、症状、剖检、病毒分离鉴定等进行判定。大口黑鲈虹彩病毒感染对大口黑鲈有致死性。Zilberg D等进行大口黑鲈虹彩病毒的人工感染试验的结果显示，以106TCID
50
/0.1mL剂量通过腹腔注射的方式攻毒，感染后第3天，病鱼呈现螺旋状游动，第4天病鱼体色发黑、无活力、腹部轻度膨大，攻毒鱼在3
‑
5天内全部死亡，濒死鱼剖检后，所有感染鱼都有急性腹膜炎症状，感染大口黑鲈虹彩病毒的鱼肝脏、胃、肠道和脾脏表层部分出现坏死和炎性病变，鱼鳔与腹腔接触表面有纤维蛋白渗出物，胃肠道的黏膜上皮层有局部坏死病灶。
[0004]由于大口黑鲈虹彩病毒在发病机理、流行病学方面的研究并不深入，再加上野生鱼类带毒情况的普遍性，目前对大口黑鲈虹彩病毒还没有采取有效的防控措施，且鉴于大口黑鲈虹彩病毒感染可以不显现任何症状，并且野生鱼带毒情况较为普遍，从传播途径尽可能切除感染机会也很有必要，因此，疫苗的研发和应用也就成了未来大口黑鲈虹彩病毒病防控的重要方向之一。专利申请CN202011348356.6公开了将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物添加至工厂化循环水养殖(RAS)系统中，柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物协同作用，抑制虹彩病毒的增殖，解决RAS养殖系统中虹彩病毒引起鱼类患病致死的技术
min，去除细胞碎片，收集离心后上清液，即获得扩增病毒原液，
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80℃保存备用，用于后续滴度实验以及灭活疫苗制备；步骤四，病毒滴度的测定：将大口黑鲈虹彩病毒N
‑
LBIV
‑
201907疫苗毒株进行传代扩增，收集病变细胞和病毒裂解液后，进行TCID
50
测定，经测定，病毒接种细胞后第5天的TCID
50
可达到10
10.55
/ml以上，得到高滴度的病毒液；步骤五，灭活处理：取保存于
‑
80℃的高滴度的病毒液于室温融化，加入福尔马林溶液使其终浓度为0.2％ (V/V)，混合均匀后置于37℃条件下灭活48
‑
72h，灭活结束后，添加终浓度为0.05％的亚硫酸钠中和残余福尔马林，即获得大口黑鲈虹彩病毒N
‑
LBIV
‑
201907灭活疫苗原液，并置于4℃冰箱保存备用；步骤六，疫苗的制备：将灭活好的疫苗原液用0.65％鱼用生理盐水稀释至效价为2
×
10
8 TCID
50 /ml，加入1:1的佐剂IMS1312混匀，即得到可直接使用的大口黑鲈虹彩病毒病细胞培养灭活疫苗。
[0011]基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：首先，本专利技术通过在南阳地区爆发大口黑鲈虹彩病毒感染的养殖场分离得到一株高致死率的虹彩病毒毒株，对其进行分离和鉴定得到虹彩病毒毒株，属于河南南阳地区首次分离得到该类虹彩病毒，经分析发现，该毒株与其他报道的毒株具有较高的同源性，但MCP的核酸序列也存在差异，该毒株的发现填补了南阳地区该毒株分离的空白，丰富了大口黑鲈虹彩病毒的研究。
[0012]其次，本专利技术对于分离得到的病毒液进行培养和灭活，制备得到大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗，经试验表明，所述灭活疫苗均具有良好的免疫原性，其中，大口黑鲈在接种免疫后，能产生较高滴度的特异性的中和抗体，在免疫后的第1d即能检测到抗体的产生，在第14d达到最高值，随后效价逐渐降低，表明本专利技术的疫苗能够较好的预防感染的发生和病程的进展，采用本专利技术的疫苗进行接种后，其30天后的保护率达到76%，而接种80天后的保护率达到100%，而采用仅包含灭活病毒液的裸疫苗进行接种后，其保护率不及本专利技术的疫苗。以上试验表明，本专利技术的疫苗具有很好的保护率，其在接种30天后的保护率高于现有报道的保护率（CN2020xxxx2797.5，30日保护率为50%）以及DNA疫苗的保护率（易婉盈等，62.5%），且在接种80日后可以达到100%的相对保护率。
[0013]综上而言，本专利技术首次从南阳地区分离得到大口黑鲈虹彩病毒，为该病毒毒株本身和流行病学的研究提供了丰富的资源，另外，该病毒毒株具有良好的免疫原性，采用其制备得到的疫苗能够刺激产生高滴度的中和抗体，具有很好的预防作用，动物实验表明，采用本专利技术的疫苗进行接种后，其30天后的保护率达到76%，高于现有技术的报道，而接种80天后的保护率达到100%。
[0014]附图说明：图1 病毒分离时的细胞病变情况：A，正常的EPC细胞；B，感染病毒后病变的EPC细胞。
[0015]图2 分子鉴定结果：M，DL5000；1，分离的病毒液；2，阴性对照。
[0016]图3 N
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LBIV
‑
201907与LMBIV
‑
NB001序列比对情况。
[0017]图4 动物回归试验结果，病死鱼表现出明显的体表溃疡症状。
[0018]图5部分病死实验鱼进行病毒检测结果，M，DL5000；1，第10代病毒液；2，阴性对照；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗，其特征在于，所述注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗中包括灭活的大口黑鲈虹彩病毒N
‑
LBIV
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201907，所述大口黑鲈虹彩病毒N
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LBIV
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201907于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202070，分类命名为大口黑鲈虹彩病毒N
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LBIV
‑
201907；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。2.根据权利要求1所述的注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗，其特征在于：所述灭活疫苗还包括佐剂，所述佐剂为IMS1312。3.根据权利要求1所述的注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗，其特征在于：所述灭活疫苗中包含10
8 TCID
50 /ml的灭活大口黑鲈虹彩病毒N
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LBIV
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201907。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述灭活疫苗的制备包括如下步骤：步骤一，EPC细胞的培养；步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N
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LBIV
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201907的增殖；步骤三，病毒的收获；步骤四，病毒滴度的测定；步骤五，灭活处理；步骤六，疫苗的制备：将灭活好的疫苗原液与佐剂混合后制备得到灭活疫苗。5.根据权利要求4所述的注射用大口黑鲈虹彩病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：步骤一，EPC细胞的培养：将EPC细胞于含10％（V/V）胎牛血清的M199培养基中进行传代培养，25℃，5%CO2恒温培养至细胞汇合，长成单层，细胞数量&gt;106/mL；步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N
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LBIV
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201907的增殖：吸出EPC细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伦广，孟晓红，邱礽，秦英惠，管翠翠，刘阳坤，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：