用于检测肿瘤标志物PD-L1的高灵敏度量子点探针、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测细胞表面肿瘤标志物PD

【技术实现步骤摘要】
用于检测肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医学/抗原检测
，具体涉及一种用于检测细胞表面肿瘤标志物PD
‑
L1的基于纳米抗体重组蛋白和荧光量子点的探针、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]基于程序性死亡受体1(PD
‑
1)和程序性死亡受体配体1(PD
‑
L1)的免疫检查点抑制原理的肿瘤治疗策略在多种肿瘤的临床治疗中展现出了巨大应用前景，因此准确对该标志物进行检测是能否开展相关治疗的关键。PD
‑
1属于B7免疫球蛋白家族，是T细胞上的一种抑制性跨膜受体。PD
‑
L1是其主要配体，广泛表达于免疫细胞以及多种恶性肿瘤细胞，包括恶性黑色素瘤、肺癌、肝癌、肾细胞癌、卵巢癌和结直肠癌等。在机体正常免疫负性调节过程中，PD
‑
1/PD
‑
L1对于调控免疫稳态发挥重要作用。然而，肿瘤细胞表面高表达的PD
‑
L1能够阻断T细胞免疫应答，产生免疫抑制性肿瘤微环境，是肿瘤免疫逃逸的一个重要机制。肿瘤细胞表面过度表达的PD
‑
L1不仅是理想的肿瘤有效治疗靶点，也是肿瘤精准诊断的一个重要标志物分子，开发PD
‑
L1的准确检测方法对开展相关的肿瘤治疗具有非常重要的意义。
[0003]现有PD
‑
L1的临床检测方法主要是基于单克隆抗体的免疫组化(IHC)技术，该方法特异性和灵敏度均不高，假阴性常见，所使用的单克隆抗体组织穿透性差，尤其对实体瘤及较厚样本组织难以准确检测，严重制约了基于PD
‑
L1/PD
‑
1的肿瘤精准诊疗的疗效和进一步推广应用。此外，也有单克隆抗体标记同位素的PD
‑
L1探针报道，但由于其分子量大，半衰期长，不能迅速从血液中清除，需要较长时间的等待才能获取较低背景的放射性成像，增加病灶部位的成像显著性，耗时比较长。基于同位素的探针也存在一些无法回避的缺陷，如放射性辐射的危害，空间分辨率低等，且该类技术涉及到同位素或者PET
‑
CT等大型设备，对设备环境等要求很高，目前尚难以临床推广。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为了克服现有肿瘤标志物PD
‑
L1检测技术中存在的缺陷和技术瓶颈，并提高PD
‑
L1检测技术的灵敏度和准确度，本专利技术提供了一种基于纳米抗体重组蛋白和荧光量子点的用于PD
‑
L1检测的高灵敏度探针、制备方法及应用。纳米抗体，具有体积小、稳定性好、亲和能力强、易修饰、组织穿透能力强和免疫原性低等优势，是非常理想的肿瘤标志物和靶点识别分子。量子点是一种新型纳米荧光染料，具有量子产率高、稳定性好、粒径小等特点，其产生的近红外光生物组织穿透能力强且受生物体自发荧光干扰小，是生物医学分子检测研究的热点荧光分子。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]本专利技术是一种高效的肿瘤标志物PD
‑
L1的检测新技术，首先外源表达识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH，然后固相合成制备含有生物素的多肽序列GK
‑
Bio，利用SortaseA酶介导的体外酶法将该重组蛋白与生物素多肽进行融合，得到生物素化识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio，最后将重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio与链酶亲和素标记量子点偶联形成探针，结合流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫吸附用于细胞表面肿瘤标志物PD
‑
L1的检测。
[0007]所述的外源表达，是在原核大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达。
[0008]本专利技术的一个目的在于，提供一种用于检测细胞表面肿瘤标志物PD
‑
L1的基于纳米抗体重组蛋白和量子点荧光的探针，该探针由以下两个部分组成：
[0009]a、生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio，
[0010]b、链霉亲和素标记量子点；
[0011]本专利技术的又一个目的在于，提供一种制备上述生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio的方法，该重组蛋白由两部分经偶联所得：
[0012]c、识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH，
[0013]d、含有生物素的多肽序列，即生物素化多肽GK
‑
Bio；
[0014]其中，所述的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH由能够识别PD
‑
L1的纳米抗体羧基端修饰所得，所述的修饰为：在所述的能够识别PD
‑
L1的纳米抗体的羧基端加入MYC标签、转肽酶A(SortaseA)识别位点、His标签序列。
[0015]所述的生物素化多肽为含有生物素基团和甘氨酸重复的多肽序列，生物素基团可以以任何方式形式存在于多肽的任何位置。
[0016]在本专利技术实施例中，该生物素化多肽的氨基端含有1
‑
3个甘氨酸重复序列，该生物素化多肽的羧基端含有生物素侧链修饰的赖氨酸组成。所述的生物素化多肽也可以是基于所述生物素化短肽的序列的改变具有类似目的的多肽，即基于该生物素化短肽基本特征获得的具有类似功能的多肽。
[0017]在本专利技术实施例中，所述的生物素化多肽选取其中一种如SEQ ID No.4所示。
[0018]在本专利技术实施例中，所述识别PD
‑
L1纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码所述能识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0019]本专利技术的一个目的在于，提供一种用于检测肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针的制备方法，包括以下步骤：
[0020]1)识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH的原核表达和纯化；
[0021]2)生物素化多肽GK
‑
Bio的制备；
[0022]3)所述识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH与生物素化多肽偶联，得生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针，其特征在于，该探针由以下两个部分偶联形成：a、生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio，b、链酶亲和素标记的量子点；其中，所述生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio由以下组分偶联获得：c、识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH，d、生物素化多肽GK
‑
Bio；其中，所述识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH由识别PD
‑
L1纳米抗体经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述识别PD
‑
L1的纳米抗体的羧基端修饰Myc标签、转肽酶A识别位点、His标签序列；所述生物素化多肽GK
‑
Bio为含有生物素基团和甘氨酸重复的多肽序列。2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针，其特征在于，所述识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针，其特征在于，所述生物素化多肽为氨基酸序列中含有1
‑
3个甘氨酸序列，或是基于所述短肽的序列的改变具有类似目的的多肽。4.根据权利要求3所述的用于检测肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针，其特征在于，所述生物素化多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的用于肿瘤标志物PD
‑
L1的高灵敏度量子点探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH的原核表达和纯化；2)生物素化多肽GK
‑
Bio的制备；3)所述识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MSH与生物素化多肽偶联，得生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio；4)所述生物素化的识别PD
‑
L1的纳米抗体重组蛋白RNB
‑
MS
‑
Bio与链酶亲和素标记量子点进行偶联，制备得...

【专利技术属性】
技术研发人员：施杰，吴志猛，李霞，刘金龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：