印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和方法。本发明专利技术提供的印第安纳沙门菌及其三种沙门菌血清抗原同时检测实时荧光定量PCR引物包括分别针对wzx基因、fliC基因和fljB基因的O:4,H:z和H:1,7三种血清抗原的实时荧光定量PCR上下游引物和探针，以及利用所述引物和探针制备的试剂盒，采用该试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，不仅可一次性筛查待测沙门菌是否为印第安纳血清型外，还可以分开单纯对沙门菌O:4,H:z和H:1,7三种血清抗原的存在与否进行准确检测和鉴定；具有更高的检测通量、更低的检测时间、更简单的操作步骤和更低的实际价格。格。格。

【技术实现步骤摘要】
印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于生物技术
，具体涉及一种印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测实时荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]沙门菌是一种重要的食源性致病菌，具有多种血清型，截至目前已发现近2700种。印第安纳血清型沙门菌(Salmonella enterica subsp.enterica Serovar Indiana，以下简称印第安纳沙门菌或S.Indiana)，隶属于沙门菌属肠道种肠道亚种(I亚种)，血清式为4:z:1,7，菌体抗原为O:4群，鞭毛一相抗原为H:z，二相抗原为H:1,7，是食品中特别是禽肉类中较常见的一种血清型，可感染人类，国内于1984年首次报道。
[0003]鉴于近年来特别是2009年以来，该血清型在临床和食品样品中呈现出检出率快速持续上升趋势，且对多种常用抗生素甚至临床一线沙门菌感染用药(如喹诺酮类和头孢类)出现多重耐药的状况日渐增加，其复杂的耐药机制和多种可移动元件给临床治疗带来极大困难。因此对该血清型沙门菌的检测、鉴定和监测工作，对开展相关研究、评估和治疗所引起的沙门菌感染具有重要意义。
[0004]目前国内外现有的印第安纳沙门菌的血清学鉴定技术，仍然以传统的血清凝集实验为主，同时也有一些基于分子生物学实验或基因组方法的血清学鉴定方法面世，以下分别介绍。
[0005](1)传统血清凝集方法，通过在不同培养基上培养具有不同生长状态的菌落，使用进口或国产血清试剂与在玻片上进行抗原抗体凝集反应，并观察反应现象，采取一定凝集流程逐步缩小范围，从而判断相对应的特异性血清群或血清因子(包括菌体O抗原46种和两种鞭毛H抗原近150种)，具体方法步骤见(食品安全国家标准微生物学检验沙门菌检验GB 4789.4
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2016)。针对印第安纳血清型，该方法需要分别对O:4、H:z和H:1,7以及其相关多价血清OMA、HMA和HMD均凝集成功，且其他非相关的多价和单价血清试剂均不凝集方可。该方法对试剂品牌和质量、菌株鞭毛抗原培养状态和操作人员经验要求较高，另外配备整套检测试剂(O和H，单价和多价试剂共约200种)价格较为昂贵，但不配备整套试剂很可能无法检出最终结果，此外还具有耗时长、工作量较大、鉴定结果不稳定的缺陷。
[0006](2)基于多重PCR和微球技术(xMAP
@
SSA)的Luminex平台，沙门菌分子血清型鉴定试剂，该方法可使用多重PCR方法一次性鉴定7种O抗原和35种H抗原，优点在于可较为准确判断血清抗原因子，如印第安纳沙门菌的三种抗原因子均包含在该试剂盒中，但缺点为：单株菌测试的价格极其昂贵、需要配套使用Luminex仪器平台、可检测的O和H抗原种类不全、无法检出未包含在检测范围内的血清因子、操作流程需要专业培训、菌株多的话耗时较长，方法参见(Dunbar,S.A.,Ritchie,V.B.,Hoffmeyer,M.R.,Rana,G.S.&Zhang,H.(2015).multiplex bead suspension arrays for the detection and serotyping of Salmonella spp.Methods in Molecular Biology,1225,1e27)。
[0007](3)全基因组学测序技术，使用二代或三代全基因组测序(WGS)技术，对测序数据进行生物信息学分析比对，在相关数据库进行查找获得血清型，方法参见(Uelze L,Borowiak M,Deneke C,et al.Performance and Accuracy of Four Open
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Source Tools for In Silico Serotyping of Salmonella spp.Based on Whole
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Genome Short
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Read Sequencing Data.Appl Environ Microbiol.2020；86(5):e02265
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19.)该方法也存在一些问题：测序价格目前仍未便宜到全民普及的价格，测序需要试剂盒提取质量较高的基因组，测序结果分析需要具有一定的生信分析能力和掌握相关的基因组处理软件，另外获得测序结果时长目前仍然不够迅速。
[0008](4)PCR或实时荧光定量PCR等分子生物学方法，针对印第安纳沙门菌的特征基因，设计相应的引物和探针，使用分子生物学技术进行检测，目前可检索到的相关专利或文献包括：
[0009](5)(A)Zhang P,Zhuang L,Zhang D,et al.Serovar
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Specific Polymerase Chain Reaction for Detection of Salmonella enterica Serovar Indiana.Foodborne Pathog Dis.2018；15(12):776
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781；
[0010](B)Wang YX,Zhang AY,Yang YQ,et al.Sensitive and rapid detection of Salmonella enterica serovar Indiana by cross
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priming amplification.J Microbiol Methods.2018；153:24
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30；
[0011](C)广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)申请的中国专利CN201911399987，16种不同血清型沙门菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。
[0012]其中，(A)方法采用单个特征性基因对印第安纳血清型沙门菌进行检测，使用了56株印第安纳沙门菌、146株非印第安纳沙门菌(31种血清型)和14株非沙门菌建立方法并使用156株临床菌株进行验证；(B)方法采用了对印第安纳特征序列进行交叉引物扩增(CPA)和核酸检测条(NADS)技术，对42株菌株(包含20种血清型的25株沙门菌和17株非沙门菌)进行了验证，并对100只鸡的肝及粪便拭子样品进行了检测；(C)方法是其公开的16种不同血清型沙门菌特异性新分子靶标及其快速检测方法中的一种，使用PCR方法进行检测，用于验证的菌株数量不明。
[0013]这三种方法基于特征性基因或引物对，使用一定数量的菌株进行方法建立和验证，但存在以下问题：
[0014](1)扩增靶标均为某一个或多个非血清抗原因子的特征性基因，由于沙门菌血清学鉴定的判定原理是基于血清抗原，因此设计原理决定了在未对沙门菌所有血清型(目前已发现近2700种)全部测试前，无法完全证明这些方法的准确性和代表性；
[0015](2)方法的准确性直接依赖于所测试的已知血清型或血清因子的菌株数目，因此需要具备数目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包括：针对印第安纳沙门菌O:4抗原的特异性上游引物序列SEQ ID NO.1：5
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CAAGCCGAGCATACCTATCAT
‑3’
；针对印第安纳沙门菌O:4抗原的特异性下游引物序列SEQ ID NO.2：5
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TGGAATCGGAGCTATTGCTTAT
‑3’
；针对印第安纳沙门菌鞭毛H:z抗原的特异性上游引物序列SEQ ID NO.3：5
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TTCTGATGCCGCTGATACTG
‑3’
；针对印第安纳沙门菌鞭毛H:z抗原的特异性下游引物序列SEQ ID NO.4：5
’‑
AGGTTTCGCAGGTTCTTTAGT
‑3’
；针对印第安纳沙门菌鞭毛H:1,7抗原的特异性上游引物序列SEQ ID NO.5：5
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CGAATGGTGCACCTAGTGTAA
‑3’
；针对印第安纳沙门菌鞭毛H:1,7抗原的特异性下游引物序列SEQ ID NO.6：5
’‑
GTCGAGATCAGCACCAGTAAAG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的一种对印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，所述印第安纳沙门菌O:4抗原对应的基因为wzx基因，所述印第安纳沙门菌鞭毛H:z抗原对应的基因为fliC基因，所述印第安纳沙门菌鞭毛H:1,7抗原对应的基因为fljB基因。3.一种对印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测的实时荧光定量PCR探针，其特征在于，包括：针对印第安纳沙门菌O:4抗原的特异性实时荧光定量PCR探针SEQ ID NO.7：5
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FAM
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TAGCTTTCCACCCGACCAATTCGG
‑3’‑
BHQ1；针对印第安纳沙门菌鞭毛H:z抗原的特异性实时荧光定量PCR探针SEQ ID NO.8：5
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HEX
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ACAGTGCCATCATCAGCAACATTGAC
‑3’‑
BHQ1；针对印第安纳沙门菌鞭毛H:1,7抗原的特异性实时荧光定量PCR探针SEQ ID NO.9：5
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CY5
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AGGTAGTGCGGTTAAATTTGACGCAGA
‑3’‑
BHQ2。4.根据权利要求3所述的一种对印第安纳沙门菌及其三种血清抗原同时检测的实时荧光定量PCR探针，其特征在于，所述印第安纳沙门菌O:4抗原对应的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡豫杰，江涛，李凤琴，王伟，董银苹，白瑶，闫韶飞，甘辛，徐进，李孟寒，李辉，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，
类型：发明
国别省市：