重组型DNA聚合酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。本发明专利技术还公开了基于所述重组型DNA聚合酶的核酸分子、表达载体、宿主细胞、制备方法、核酸的扩增方法和试剂盒。核酸的扩增方法和试剂盒。核酸的扩增方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
重组型DNA聚合酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种重组型DNA聚合酶及其应用。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术被广泛地应用于DNA分子扩增技术中，其中DNA聚合酶作为PCR中的关键组分对DNA的复制起着至关重要的作用。
[0003]重组型高保真DNA聚合酶是一种校对DNA聚合酶，具有续进增强域和通用引物退火特性，在保持优良的保真性的同时，扩增量和延伸性也有显著提升。该聚合酶适用于准确性高的应用(如克隆、测序、定点突变)，可具有5
′→3′
DNA聚合酶活性、3
′→5′
外切酶活性。
[0004]目前，国内外关于高保真DNA聚合酶的研究及应用还在不断地推进，大量的专家学者探索了聚合酶的自身连接方式乃至整体结构域，深入分析了DNA聚合酶活性域、外切酶校对活性域和续进增强域的组成，并在此基础上引入新的延伸因子等。然而，通常的高保真DNA聚合酶碱基延伸速度与扩增片段的长度低于普通的Taq DNA聚合酶，尤其是对于难扩增的模板片段，扩增效率较低。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要针对高保真酶对难扩增片段的扩增效率差的问题，提供一种重组型DNA聚合酶及其应用。
[0006]重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。
[0007]在其中一个实施例中，所述Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
[0008]在其中一个实施例中，所述Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
[0009]重组型DNA聚合酶核酸分子，其含有编码所述的重组型DNA聚合酶的核苷酸序列。
[0010]表达载体，包括所述的重组型DNA聚合酶核酸分子。
[0011]宿主细胞，包括所述的表达载体。
[0012]在其中一个实施例中，所述宿主细胞是微生物细胞。
[0013]一种试剂盒，其含有所述的重组型DNA聚合酶。
[0014]所述的重组型DNA聚合酶的制备方法，在所述重组型DNA聚合酶表达的条件下培养所述的宿主细胞。
[0015]核酸的扩增方法，在适合模板扩增的条件下，采用所述的重组型DNA聚合酶进行PCR扩增。
[0016]本专利技术对Pfu DNA聚合酶
‑
Sso7d蛋白形成的重组型DNA聚合酶进行研究，得到多种重组型DNA聚合酶，发现Sso7d蛋白直接连接到Pfu DNA聚合酶的C端，或者通过特定的蛋白连接肽连接在C端能够明显提高聚合酶对于扩增困难序列的扩增活性，对于PCR扩增的便利
应用提供基础。
附图说明
[0017]图1为本专利技术实施例1
‑
2的蛋白纯化结果图，其中A1、A2分别为实施例1的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例1的蛋白亲和层析的第4泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例2的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例2的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
[0018]图2为本专利技术实施例3
‑
4的蛋白纯化结果图，其中A1、A2分别为实施例3的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例3的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例4的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例4的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
[0019]图3为本专利技术实施例5
‑
6的蛋白纯化结果图，其中A1、A2分别为实施例5的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例5的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例6的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例6的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
[0020]图4为本专利技术实施例7
‑
10的蛋白亲和层析图，其中A、B、C、D分别为实施例7
‑
10的蛋白亲和层析图，E为对应的电泳图；
[0021]图5为本专利技术实施例7
‑
10的蛋白阳离子交换柱层析图，各蛋白阳离子交换柱层析均取自图4的第2泳道对应的蛋白，其中A1、A2分别为实施例7的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例8的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例9的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例10的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
[0022]图6为本专利技术实施例1
‑
10的蛋白浓度测定结果图；
[0023]图7为本专利技术以棉花为模板的实施例1
‑
10的扩增结果图；
[0024]图8为本专利技术以花生为模板的实施例1
‑
10的扩增结果图；
[0025]图9为本专利技术以水稻为模板的实施例1
‑
10的扩增结果图；
[0026]图10为本专利技术以小麦为模板的实施例1
‑
10的扩增结果图；
[0027]图11为本专利技术以玉米为模板的实施例1
‑
10的扩增结果图。
具体实施方式
[0028]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0029]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相
关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0030]“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于描述可以包含部分或全长蛋白质的蛋白质分子。
[0031]如本领域已知的，“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“寡肽”是其α碳通过肽键进行连接的氨基酸(通常为L
‑
氨基酸)的链，所述肽键通过一个氨基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组型DNA聚合酶，其特征在于，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。2.根据权利要求1所述的重组型DNA聚合酶，其特征在于，所述Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。3.根据权利要求1或2所述的重组型DNA聚合酶，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晓文，李妍，曹文刚，王文朋，李刚，东昱汝，
申请(专利权)人：北京擎科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：