氯化物诱导型原核表达系统技术方案

本发明专利技术涉及重组细菌、重组质粒、药物组合物和药盒、以及包含氯离子的重构介质用于重构所述重组细菌的用途。所述重组细菌的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】氯化物诱导型原核表达系统


[0001]本专利技术涉及重组细菌、重组质粒、药物组合物和药盒，以及包含氯离子的重构介质(reconstitution medium)重构重组细菌的用途。

技术介绍

[0002]生物药物或生物治疗剂涉及广泛的医学生物学产品，例如，通过包括重组DNA技术的生物学过程生产的那些产品。
[0003]生物药物或生物治疗剂包括，例如，与待治疗受试者的多肽相同或几乎相同的多肽，例如刺激血液产生的蛋白质促红细胞生成素，生物合成的人胰岛素及其类似物，或单克隆抗体(它们可以被制备以特异地抵制或阻断任何给定的靶标，例如特定的细胞类型、特定的多肽或内源性抗原)，以及设计通过中和靶标mRNA分子来调节基因表达或翻译的RNA分子。
[0004]生物药物对许多医学药物领域产生了深远的影响，为许多疾病的治疗增加了主要的治疗选择，包括尚没有有效治疗方法的一些疾病以及先前存在的治疗方法明显不足的其他疾病。
[0005]然而，因为生物疗法的成本远高于传统药物生物，药物的出现也引发了复杂的监管问题和重大的药物经济学问题。由于许多生物药物被用于在剩余的生命中治疗慢性疾病或用于治疗无法治愈的癌症，这就造成该成本因素特别重要。
[0006]此外，生物药物通常具有有限的抗降解(例如蛋白酶或核酸酶降解)稳定性的缺点，尤其是在应用于受试者之后。生物药物分子的部分或完全降解导致生物药物在施用于受试者后的半衰期显著缩短。
[0007]代替将生物药物直接应用于受试者，通常需要替代的应用模式以向受试者提供足够量的相应生物药物。
[0008]例如，诸如多肽的生物药物可以由分泌相应多肽的自体或异源细胞提供，或者可以通过使用基因转移方法例如病毒载体将编码所需多肽的基因转移至靶组织来提供。
[0009]市售的例子是含有人类胚胎细胞的真皮替代品，该替代品可以在应用于患病伤口区域后分泌各种生长因子。
[0010]真皮替代品Dermagraft由成纤维细胞、细胞外基质和生物可吸收支架组成。Dermagraf由来自捐赠的新生儿包皮组织的人成纤维细胞制成。在制造过程中，人类成纤维细胞被接种到生物可吸收的乙交酯丙交酯共聚物(polygalactin)支架上。
[0011]市售的真皮替代品Apligraf包含源自新生儿包皮的两种细胞类型。活的人类角质形成细胞和成纤维细胞被嵌入伤口1型胶原基质中。
[0012]上述皮肤替代品的缺点是制造过程导致的相当高价格。此外，必须测试用于真皮替代品的相应细胞是否有迹象感染了人类病毒，例如1型和2型免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、人类嗜T淋巴细胞病毒1型和2型以及EB病毒。
[0013]另一个市售的例子是voretigene neparvovec
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rzyl(LUXTURNA)。LUXTURNA是一种
用于视网膜下注射的基于腺相关病毒载体的基因治疗悬浮剂，旨在将编码人视网膜色素上皮65kDa蛋白(RPE65)的正常拷贝基因递送给生物活性RPE65水平减少或缺乏的个体的视网膜细胞。
[0014]病毒产品或任何其他基于病毒载体的基因治疗产品的缺点是高制造成本和生产规模扩大上的限制。
[0015]例如，WO 9714806 A2描述了通过非侵袭性细菌向受试者递送生物活性多肽。
[0016]WO 961 1277A1涉及使用微生物作为向受试者递送治疗化合物的运载体。
[0017]WO 201 1160062 A2提供了一种治疗炎性肠病的方法，包括向受试者施用能够在肠粘膜中原位产生治疗有效量的白介素27(IL
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27)或其变体或片段的重组微生物。
[0018]US 2013209407 A涉及一种大肠杆菌的共生菌株，其可以定殖于泌尿生殖道和/或胃肠道粘膜，并且可以通过分泌异源抗微生物多肽来阻断病原体的感染和/或致病活性。
[0019]已知几种异源多肽表达系统在细菌中使用诱导型或组成型启动子。
[0020]组成型启动子优选在所有情况下都在细胞中具有活性，从而允许，优选高水平地，产生所需的异源多肽，然而，这也可能导致显著增加的代谢负担，并因此降低所用细菌的生存力和/或生长速率。这又会在生产工艺的发酵过程中直接影响细菌产量。代谢负荷越高，发酵过程中的产量可能越低。
[0021]相反，受调节的、优选可诱导的启动子将响应特定诱导物而具有活性或启动子活性增强。对于在调节型、优选诱导型启动子的控制下表达所需的异源多肽的重组细菌，在将相应的诱导剂应用于重组细菌时，启动子将成为活性启动子并表达编码相应异源多肽的目的核酸。这在重组细菌的制造过程中是尤其有利的。由于代谢负荷最小化，因此可以实现重组细菌的更高产量。
[0022]广泛使用的受控基因表达系统有，例如，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的乳链菌肽(nisin)控制的基因表达系统(NICE)。
[0023]本领域技术人员熟知，乳链菌肽是由几种乳酸乳球菌菌株产生的具有广谱宿主的34
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氨基酸羊毛硫抗生素(lantibiotic)多肽。乳链菌肽被广泛用作食品中的防腐剂。最初，乳链菌肽通过核糖体合成为前体。在随后的酶促修饰之后，修饰的分子跨细胞质膜转运并加工成其成熟形式。
[0024]当目的基因被置于乳链菌肽系统的诱导型启动子PnisA后面时，可以通过添加乳链菌肽来诱导目的核酸序列的表达。
[0025]乳链菌肽控制的基因表达系统优选提供高蛋白质产量，然而，它依赖于外部诱导物。当用于对受试者施用时，添加乳链菌肽是昂贵的，因为这需要提供医药级的乳链菌肽，从而引起了额外的监管问题。
[0026]由于乳链菌肽是一种多肽，它也易于被蛋白酶降解。因此，在向受试者施用在乳链菌肽启动子控制下表达目的核酸序列的重组细菌之后，如果期望目的核酸序列连续表达，则必须优选重复地提供乳链菌肽。
[0027]为了连续表达目的核酸序列而添加乳链菌肽的要求，进一步限制了相应重组细菌的适用施用途径。
[0028]例如，全身施用在乳链菌肽启动子控制下表达目的核酸序列的重组细菌，将另外需要向受试者施用可能显著量的乳链菌肽，以便在受试者体内达到诱导相应目的核酸序列
表达的乳链菌肽浓度。此外，必须考虑乳链菌肽的毒性谱以及获得制药级乳链菌肽的必要性。
[0029]专利技术概述
[0030]本专利技术的一个目的是提供一种细菌表达系统，其允许表达编码至少一个异源因子的至少一个核酸序列，而不会负面影响所用的相应重组细菌在施用给受试者之前的生存力，其中所述至少一个异源因子独立地是异源多肽或其复合物，并且其中所述异源多肽包含至少一个真核多肽、其至少一个片段或其组合。
[0031]所述细菌表达系统应允许至少在施用于受试者时提供相应异源因子的诱导型表达。
[0032]所述细菌表达系统还应允许，优选地在一段长时间段内，对受试者容易地施用至少一个有益因子，而无需提供额外的诱导剂，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组细菌，其包含：a)至少一个核酸序列，其与氯化物诱导型原核启动子功能性偶联并编码至少一个异源因子，所述异源因子独立地是异源多肽或其复合物，和b)至少一个控制所述氯化物诱导型启动子活性的原核调节基因，其中所述异源多肽包含至少一个真核多肽、其至少一个片段或其组合。2.一种重组核酸，其包含：a)至少一个核酸序列，其与氯化物诱导型原核启动子功能性偶联并编码至少一个异源因子，所述异源因子独立地是异源多肽或其复合物，和b)至少一个控制所述氯化物诱导型启动子活性的原核调节基因，其中所述异源多肽包含真核多肽、其至少一个片段或其组合。3.根据权利要求1的重组细菌，其中所述与氯化物诱导型原核启动子功能偶联并编码至少一个异源因子的至少一个核酸序列和/或所述至少一个控制所述氯化物诱导型启动子活性的原核调节基因，各自独立地位于所述重组细菌的染色体和/或至少一个质粒上。4.根据权利要求1或3任一项的重组细菌或根据权利要求2的重组核酸，其中所述氯化物诱导型启动子和/或所述至少一个调节基因各自独立地来自于细菌物种，优选革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。5.根据权利要求1或3至4中任一项的重组细菌或根据权利要求2或4中任一项的重组核酸，其中所述氯化物诱导型启动子是来自分类学乳酸菌目的细菌物种，优选乳酸乳球菌，的PgadC。6.根据权利要求1或3至4中任一项的重组细菌或根据权利要求2或4中任一项的重组核酸，其中所述调节基因编码来自分类学乳酸菌目的细菌物种，优选地乳酸乳球菌，的gadR。7.根据权利要求1或3至6任一项所述的重组细菌或根据权利要求2或4至6任一项所述的重组核酸，其中所述氯化物诱导型启动子和所述至少一个调节基因被布置在氯化物诱导型基因表达盒中，其中所述氯化物诱导型启动子布置在所述至少一个调节基因的下游，并且其中所述氯化物诱导型基因表达盒控制编码所述至少一个异源因子的至少一个核酸序列的转录。8.根据权利要求7的重组细菌或重组核酸，其中所述氯化物诱导型基因表达盒包含SEQ ID No 2的核酸序列或由其组成，并控制编码至少一个异源因子的至少一个核酸序列的转录。9.根据权利要求1、3或7至8中任一项所述的重组细菌或根据权利要求2、或7至8中任一项所述的重组核酸，其中所述至少一个异源因子在受试者中具有治疗性和/或预防性作用。10.根据权利要求1、3或7至9任一项的重组细菌或根据权利要求2或7至9任一项的重组核酸，其中所述至少一个异源因子是异源多肽或其复合物，分别包含至少一个真核多肽、其至少一个片段或其组合。11.根据权利要求1、3或7至10中任一项的重组细菌或根据权利要求2或7至10中任一项的重组核酸，其中所述至少一个异源因子选自由以下组成的组：来自真核物种，优选哺乳动物物种，更优选人的多肽激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、酶、神经肽、抗体、其前体、其片段和它们的组合。12.根据权利要求1或3至11中任一项所述的重组细菌，其进一步包含至少一个失活的
基因，所述基因编码所述重组细菌的存活所必需的必需蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：塞洛尔克斯股份公司，
类型：发明
国别省市：