本发明专利技术提供了一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其通过基因工程途径使林可链霉菌中Lrp家族转录调控基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌；其中，所述SLCG_5407基因的序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供了一种上述构建方法得到的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的应用。本发明专利技术通过基因工程技术在林可链霉菌中失活SLCG_5407，能够获得林可霉素高产工程菌株，为提高林可霉素发酵产量提供技术支持。提高林可霉素发酵产量提供技术支持。提高林可霉素发酵产量提供技术支持。
【技术实现步骤摘要】
一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法与应用。
技术介绍
[0002]林可霉素(lincomycin)在工业生产上主要由林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)发酵产生，是一种林可酰胺类抗生素，其活性A组分用于治疗金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和某些厌氧的革兰氏阴性菌所引起的感染。林可霉素通过与细菌核糖体50s亚基中的23srRNA的中心环疏水结合，阻止肽链延长，以达到抑菌效果。林可霉素衍生物，特别是克林霉素，在治疗由厌氧菌引起的感染较林可霉素更加有效。我国是林可霉素原料药的最大生产国和主要出口国之一，但相比国外先进水平，工业发酵产量并不理想。由此可见，提高林可霉素的发酵产率具有重要的经济价值，有助于提升我国相关企业的核心竞争力。
[0003]过去，林可霉素工业生产菌株主要通过物理或化学诱变方法获得，而传统的诱变技术不但耗时耗力，且随机性较大，无法对林可霉素高产的精准高效育种提供理论指导。本专利技术目的就是通过基因工程技术定向改造林可链霉菌的编码基因，进而获得林可霉素高产工程菌株，用于高效生产林可霉素或其合成过程中的产物。
[0004]亮氨酸应答调控蛋白(Leucine responsive regulatory protein,Lrp)存在于原核生物中，是一类重要的转录调控因子，主要通过应答氨基酸等配体参与代谢过程。近年来研究发现，Lrp可控制放线菌中多样的生理代谢过程，包括抗生素生物合成、菌丝体形态分化、氨基酸代谢、细菌持久性和毒力等。产抗生素放线菌中普遍分布Lrp家族蛋白，如SACE_Lrp、SACE_5717、SLCG_Lrp等，对其进行改造可提高相应抗生素的产量，暗示其在抗生素高产育种中的普遍重要性。
技术实现思路
[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种Lrp家族转录调控基因SLCG_5407改造型林可链霉菌的构建方法与应用，利用该SLCG_5407基因改造型林可链霉菌生产林可霉素，可大大提高林可霉素的产量。
[0006]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0007]一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，通过基因工程途径使林可链霉菌中Lrp家族转录调控基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌；其中，所述SLCG_5407基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]作为本专利技术的优选方式之一，所述SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建，以林可链霉菌LCGL为出发菌株。
[0009]作为本专利技术的优选方式之一，所述SLCG_5407基因的产物用于负向调控林可霉素
生物合成。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，包括如下具体步骤：
[0011](1)以林可链霉菌LCGL基因组为模板，以5407
‑
p1、5407
‑
p2、5407
‑
p3和5407
‑
p4为引物，分别扩增SLCG_5407基因的上、下游同源片段；
[0012]所述5407
‑
p1、5407
‑
p2、5407
‑
p3和5407
‑
p4引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；
[0013](2)将扩增后、回收好的SLCG_5407基因上下游同源片段分别进行双酶切处理后连接到pKC1139载体上，得到pKC1139
‑
Δ5407质粒；
[0014](3)将pKC1139
‑
Δ5407质粒通过PEG3350介导转化到林可链霉菌LCGL原生质体中，待其同源重组后，筛选得到缺失SLCG_5407基因的突变株ΔSLCGL_5407，即目标菌株。
[0015]作为本专利技术的优选方式之一，该方法同样适用于工业高产菌株LA219X(本领域可直接购买得到的菌株)，即：以工业高产菌株LA219X为出发菌株，并通过基因工程途径使林可链霉菌LA219X中Lrp家族转录基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌LA219X。
[0016]一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的应用，将通过上述构建方法得到的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌用于林可霉素的发酵生产。
[0017]本专利技术相比现有技术的优点在于：
[0018]本专利技术研究筛选到了林可霉素生物合成负调控子SLCG_5407，通过基因工程技术在林可链霉菌中失活SLCG_5407，能够获得林可霉素高产工程菌株，为提高林可霉素发酵产量提供技术支持。
[0019]经研究，在林可链霉菌LCGL中敲除SLCG_5407时林可霉素产量提高了25％，而在ΔSLCGL_5407突变株中回补SLCG_5407基因，林可霉素产量得到恢复，表明SLCG_5407是一个参与林可霉素生物合成的负调控因子；且该方法同样适用于工业高产菌株LA219X，使其林可霉素产量提高12.1％。
附图说明
[0020]图1是SLCG_5407基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息；
[0021]图2是ΔSLCGL_5407突变株的构建示意图；
[0022]图3是ΔSLCGL_5407突变株的PCR鉴定结果图(图3中，SLCG_5407基因未敲除
‑
909bp；SLCG_5407基因敲除后
‑
189bp；M：5000bp DNA Marker)；
[0023]图4是ΔSLCGL_5407/pIB139
‑
5407回复菌株的PCR鉴定图(图4中，PCR产物为安普霉素抗性基因
‑
776bp；并且，M：5000bp DNA Marker；+：pIB139；
‑
：水；1：ΔSLCGL_5407/pIB139
‑
5407；2：ΔSLCGL_5407/pIB139)；
[0024]图5是LCGL/pIB139
‑
5407过表达菌株的PCR鉴定图(图5中，PCR产物为安普霉素抗性基因
‑
776bp；并且，M：5000bp DNA Marker；+：pIB139；
‑
：水；1：LCGL/pIB139
‑
5407；2：LCGL/pIB139)；
[0025]图6是LCGL及其ΔSLCGL_5407突变株的林可霉素产量分析图；
[0026]图7是出发菌株LCGL、缺失突变株ΔSLCGL_5407、缺失回补菌株ΔSLCGL_5407/pIB139本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，通过基因工程途径使林可链霉菌中Lrp家族转录调控基因SLCG_5407缺失，继而获得目标所需的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌；其中，所述SLCG_5407基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，所述SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建，以林可链霉菌LCGL为出发菌株。3.根据权利要求1所述的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，所述SLCG_5407基因的产物用于负向调控林可霉素生物合成。4.根据权利要求1～3任一所述的SLCG_5407基因改造型林可链霉菌的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)以林可链霉菌LCGL基因组为模板，以5407
‑
p1、5407
‑
p2、5407
‑
p3和5407
...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴杭，许婉莲，张部昌，李秉霖，伊静，蔡新露，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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