一种裂褶菌发酵物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种裂褶菌发酵物的制备方法、由该方法制备得到的裂褶菌发酵物、含有该裂褶菌发酵物(含裂褶菌素)的皮肤用化妆品、以及该裂褶菌发酵物在制备药物或皮肤用化妆品中的用途。其中该裂褶菌发酵物的制备方法包括如下步骤：种子活化、种子液制备、深层发酵、粗多糖提取、去蛋白、纯化、精制。通过本发明专利技术的制备方法得到的裂褶菌发酵物，具有吸收速度快、稳定性高的良好技术效果。性高的良好技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种裂褶菌发酵物及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及一种裂褶菌发酵物，其制备方法，以及该裂褶菌发酵物的用途。
[0002]
技术介绍

[0003]裂裥菌素（Sizofiran或Schizophyllan），又称为西佐喃、裂裥多糖或裂褶多糖，是由裂褶菌（Schizophyllum commune）子实体经提取或液体深层发酵产生的一种中性多糖，其分子结构式如下所示：。
[0004]裂裥菌素是以葡萄糖为单一组分的β
‑
(1
‑
3)
‑
D葡聚糖，其中每三个葡萄糖分子上链接有一个β
‑
(1
‑
6)葡萄糖苷分支（参见郑必胜等，羧甲基裂褶多糖的制备及其保湿活性研究，现代食品科技，2017，第33卷第8期，第254页）。裂裥菌素独特的三螺旋结构和恰当的分支度（0.33），使它在调节皮肤免疫、促进皮肤细胞增殖、胶原蛋白合成、延缓衰老、清除自由基、对抗紫外线、晒后修复、抗炎方面均有很好的作用，加之其天然水溶，来源安全，非常适合在化妆品和皮肤病上的应用。裂裥菌素的护肤作用，具体表现为保湿、抗氧化之功效，因而可用于改善皮肤润泽度，并延缓皮肤衰老（参见张琪等，裂褶多糖保湿功效评价，中国食品学报，2015年，第15卷第3期，第223
‑
227页）。
[0005]裂裥菌素的制备主要有两种途径，一是从野生或人工栽培的子实体中提取获得，二是从发酵培养的发酵液或菌丝体中提取获得。但从途径一的子实体中难以大量提取裂裥菌素，因为野生菌的子实体产量低二人工栽培的裂褶菌周期长且效率低下。在发酵培养中又可分为液体发酵法和固体发酵法，其中液体发酵发的生产周期短、产量大、易于大规模工业生产，而固体发酵虽然具有设备简单、培养基成本低、能耗低等优点，但存在发酵周期长的缺点。因此，液体发酵仍然是生产裂裥菌素的主要途径。
[0006]液体发酵的产物经过提取后将得到裂裥菌素的粗多糖，再经过纯化后可得到高品质的裂褶菌发酵物。作为生物制品，发酵和提取裂裥菌素的方法将会影响所得产品的吸收速度、稳定性等性质。如何加快化妆品中裂裥菌素组合物的吸收速度，提高裂裥菌素的稳定
性，成为本领域技术人员需要解决的技术问题。
[0007]
技术实现思路

[0008]本专利技术涉及一种裂褶菌发酵物的制备方法，包括如下步骤：（1）种子活化：取裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）斜面菌种接入PDA培养基，在25
‑
30℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；（2）种子液制备：将所述活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在25
‑
30℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液；（3）深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量5
‑
10重量%，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖12
‑
18重量%、酵母粉7
‑
8重量%、蛋白胨5
‑
7重量%、KH2PO
4 0.5
‑
1.0重量%和MgSO4·
7H2O 0.2
‑
0.6重量%；（4）粗多糖提取：将步骤（3）得到的发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在60
‑
70℃下搅拌3
‑
5小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩汁原体积的1/2至1/3，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液；（5）去蛋白：将步骤（4）得到的粗多糖液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3
‑
5次，得到去蛋白的粗多糖提取液；（6）纯化：将步骤（5）得到的粗多糖提取液使用孔径为50
‑
100 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并将过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；（7）精制：将步骤（6）得到的初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素
‑
琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚
‑
硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物。
[0009]为了进一步实现本专利技术的目的，优选地，步骤（1）中所述的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）为保藏编号为CFCC NO.6812、CFCC NO.83457、ACCC NO.50875的裂褶菌。这些裂褶菌均为可商业购买的菌种，例如可购于中国林业微生物菌种保藏管理中心或者中国农业微生物菌种保藏管理中心。
[0010]优选地，步骤（3）中的深层发酵过程依次经历如下四个阶段：阶段一为开始发酵的0
‑
1天，发酵条件控制为搅拌速度500rpm，通气量0.5 vvm，温度30℃，溶氧量D0控制为40%
‑
45%，调节pH为4.5
‑
5的范围；阶段二为开始发酵的1
‑
2天，发酵条件控制为搅拌速度450rpm，通气量1.0 vvm，温度27℃，溶氧量D0控制为36
‑
40%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于10重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为12
‑
18重量%，调节pH为5
‑
6的范围；阶段三为开始发酵的3
‑
5天，发酵条件控制为搅拌速度600rpm，通气量1.5 vvm，温度40℃，溶氧量D0控制为15
‑
20%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于12重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为15
‑
18重量%，同时以液体形式流加如下浓度的物质：1 mg/L的硫胺素、0.3 mg/L的甘氨酸、0.6 mg/L的L
‑
谷氨酸、0.05 g/L的柠檬酸、0.20 mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30 mg/L的月桂酸，调节pH为4.5
‑
5的范围；
阶段四为开始发酵的第6天，发酵条件控制为搅拌速度为450rpm，通气量0.5 vvm，温度32℃，溶氧量D0控制为15
‑
20%，调节pH为5
‑
5.5的范围。
[0011]优选地，步骤（5）中酶解所用的酶为胰蛋白酶和β
‑
1,3
‑
葡聚糖酶的混合物，其比例为1:4，添加量为0.02
‑
0.05重量%。
[0012]优选地，本专利技术的裂褶菌发酵物中含有裂裥菌素。
[0013]在本专利技术中，将裂褶菌发酵物中的裂裥菌素作为指标来评价本专利技术裂褶菌发酵物的品质和效果。
[0014]本专利技术还提供一种由本专利技术的方法制备的裂褶菌发酵物。
[0015]本专利技术还提供一种皮肤用化妆品，其中含有本专利技术的裂褶菌发酵物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂褶菌发酵物的制备方法，包括如下步骤：（1）种子活化：取裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）斜面菌种接入PDA培养基，在25
‑
30℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；（2）种子液制备：将所述活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在25
‑
30℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液；（3）深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量5
‑
10重量%，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖12
‑
18重量%、酵母粉7
‑
8重量%、蛋白胨5
‑
7重量%、KH2PO
4 0.5
‑
1.0重量%和MgSO4·
7H2O 0.2
‑
0.6重量%；（4）粗多糖提取：将步骤（3）得到的所述发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在60
‑
70℃下搅拌3
‑
5小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩汁原体积的1/2至1/3，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液；（5）去蛋白：将步骤（4）得到的所述粗多糖液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3
‑
5次，得到去蛋白的粗多糖提取液；（6）纯化：将步骤（5）得到的所述粗多糖提取液使用孔径为50
‑
100 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并将过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；（7）精制：将步骤（6）得到的所述初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素
‑
琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚
‑
硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物。2.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵物的制备方法，其中步骤（1）中所述的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）为保藏编号为CFCC NO.6812、CFCC NO.83457、或ACCC NO.50875的裂褶菌。3.根据权利要求1所述的裂褶菌发酵物的制备方法，其中步骤（3）中所述的深层发酵过程依次经历如下四个阶段：阶段一为...

【专利技术属性】
技术研发人员：单玉飞，吴雅勤，
申请(专利权)人：广州恒雅生物化工有限公司，
类型：发明
国别省市：