山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒。PCR引物组，包括SEQ ID No.1

【技术实现步骤摘要】
山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学鉴定
，涉及一种可以快速鉴定山瑞鳖性别的PCR扩增引物组、位点、方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]山瑞鳖(Palea steindachneri)隶属于爬行纲龟鳖目鳖科山瑞鳖属，俗称山瑞、瑞鱼、甲鱼、团鱼等，外形与中华鳖十分相似，呈圆形，但体形稍大，而且较为肥厚。其原产地为中国和越南，国内分布于广西、广东、贵州、云南、海南、香港、台湾等省，其中以广西西部地区数量较多。
[0003]由于野生山瑞鳖资源长期破坏性捕捉，加之栖息区域变小，栖息环境退化，野生山瑞鳖资源衰减严重。山瑞鳖现被列入《中国国家重点保护野生动物名录》，保护级别为二级，列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录二。出于物种保护和利用目的，山瑞鳖已列入《人工繁育国家重点保护水生野生动物名录(第一批)》(2017年11月13日)。养殖业者已建立了较为成熟的人工繁养殖技术。在海南、广东、广西、福建、浙江等省区均有养殖场分布。山瑞鳖是我国重要的名贵水产品之一。其养殖生产性能存在显著的性别二态性，成体雄鳖规格较雌鳖大30％以上。因此，山瑞鳖性别早期鉴定技术具有重大实际应用意义。首先，山瑞鳖产业对单性养殖和性控育种有强烈需求，但早期分子鉴定技术尚存在空白。从形态特征鉴别性别需要养殖1年以上，平均规格250克以上才可实施，且准确度没有保障。其次，出于对野生山瑞鳖繁殖生态学的研究，掌握野生种群各年龄规格群体性别比例，性别分子鉴定对于开展山瑞鳖种质保护评价具有重要价值。
[0004]目前关于山瑞鳖的文献报道十分稀少，且仅限于人工繁育、养殖和病害防治方面。关于山瑞鳖的性别分子鉴定技术还未有涉及。目前鳖属动物中中华鳖有性别分子鉴定技术，其开发背景为中华鳖已明确性别决定机制为ZW基因决定，性染色体已经定位，且有基因组测序信息供比对筛选性别鉴定引物。而山瑞鳖尚无开展基因组测序，NCBI数据库仅有其线粒体基因组序列，且核基因信息为零，性别决定型未明确，开发一款山瑞鳖的性别分子鉴定技术尤为困难。
[0005]另外根据相关中华鳖性别分子鉴定位点信息，对中华鳖性别鉴定引物组进行直接扩增和多种简并修饰后扩增，并不能用于跨物种的山瑞鳖性别鉴定，故根据已报道中华鳖性别分子鉴定的位点和引物组，无法通过简单尝试解决山瑞鳖性别分子鉴定难题。
[0006]因此，通过各种技术尝试探索，开发出山瑞鳖性别鉴定技术，对山瑞鳖单性养殖技术和性控育种技术的实现，对山瑞鳖物种保护评估与开发利用具有重要推动作用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一个目的是针对现有技术空白，提供一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，且该方法较常
规PCR方法具有以下2个明显优点：一是该PCR方法无需上游基因组提取步骤，节省时间、试剂耗材成本；二是该PCR方法样本可以从初孵稚鳖至成鳖期采用无创或微创法获得。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种快速鉴定山瑞鳖性别的试剂盒。
[0010]本专利技术的上述第四个目的是提供一种用于鉴定山瑞鳖雌性特异的核酸序列位点。
[0011]本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案实现：一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组，该引物组序列如下：
[0012]雌性特异正向引物：5
’‑
CCAAGAGTCATCAGGAACGCAC
‑3’
，见SEQ ID No.1；
[0013]雌性特异反向引物：5
’‑
CATCTTCCTCCTCGGGTTCCTC
‑3’
，见SEQ ID No.2；
[0014]内参正向引物：5
’‑
TTGGATCCCTATTAGGTGCTTGCCT
‑3’
，见SEQ ID No.3；
[0015]内参反向引物：5
’‑
TGATGTGTGTAGTAGGGGTAGGATG
‑3’
，见SEQ ID No.4。
[0016]本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案实现：
[0017]方案一：将待检测山瑞鳖提取基因组DNA；以上述基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物序列进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现834bp和1589bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现834bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雄性。
[0018]上述提及的PCR扩增反应体系为：
[0019][0020][0021]PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程30个循环，最后72℃延伸5min。
[0022]方案二：以山瑞鳖全血作为样本，采用PicoPure
TM DNAExtraction Kit的蛋白酶K进行样本裂解，得到样本裂解混合液；对样本裂解混合液进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现834bp和1589bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现834bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雄性。
[0023]上述样本裂解体系包括山瑞鳖全血0.1
‑
0.5μL，蛋白酶k溶液(1ug/μL)10.5
‑
10.9μL，总体积共11μL。
[0024]上述样本裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min；
[0025]所述山瑞鳖全血为初孵稚鳖未脱落卵黄囊内存留的血液，或稚鳖、成鳖后肢皮肤针刺采集的血液。
[0026]上述PCR扩增体系包括
[0027][0028]PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程30个循环，最后72℃延伸5min。
[0029]作为优选，所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
[0030]本专利技术的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种山瑞鳖性别快速鉴定试剂盒，包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物。
[0031]本专利技术的上述第四个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于鉴定山瑞鳖性别的位点，包括雌性特异连锁片段1589bp，序列见SEQ ID No.5；检验PCR成功的山瑞鳖线粒体cytB内参基因片段834bp，序列见SEQ ID No.6。
[0032]本专利技术的有益效果是：
[0033](1)本专利技术中的山瑞鳖性别鉴定PCR引物组，该引物组可在山瑞鳖各发育生长时期鉴定其性别；
[0034](2)本专利技术中的山瑞鳖性别快速PCR鉴定方法，该方法不受山瑞鳖发育时期限制，操作简便，结果准确直观，采用微量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组，其特征在于该引物组序列如下：雌性特异正向引物：5
’‑
CCAAGAGTCATCAGGAACGCAC
‑3’
，见SEQ ID No.1；雌性特异反向引物：5
’‑
CATCTTCCTCCTCGGGTTCCTC
‑3’
，见SEQ ID No.2；内参正向引物：5
’‑
TTGGATCCCTATTAGGTGCTTGCCT
‑3’
，见SEQ ID No.3；内参反向引物：5
’‑
TGATGTGTGTAGTAGGGGTAGGATG
‑3’
，见SEQ ID No.4。2.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于该方法是：将待检测山瑞鳖提取基因组DNA；以上述基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物序列进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现834bp和1589bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现834bp大小的条带时，山瑞鳖性别为雄性。3.根据权利要求2所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于PCR扩增反应体系为：PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程30个循环，最后72℃延伸5min。4.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于该方法是：以山瑞鳖全血作为样本，采用Pic...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓军，关文志，牛宝龙，楼宝，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：