一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法技术

本发明专利技术提供了一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法，涉及生命科学技术领域。本发明专利技术所述方法通过使用Hdcok对得到并通过结构比对与MD模拟筛选出最佳复合体模型、参照定向进化实验对复合体模型进行特定突变、每个结构执行1μs时长的全原子分子动力学模拟和对每段轨迹进行能量计算机氢键盐桥分析，得出进化路径的能量学和结构动力学细节。利用本发明专利技术所述方法，成功把一个噬菌体RNAP从识别其原始启动子切换到另一个启动子上。识别其原始启动子切换到另一个启动子上。识别其原始启动子切换到另一个启动子上。

【技术实现步骤摘要】
一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法


[0001]本专利技术属于生命科学
，具体涉及一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法。

技术介绍

[0002]近年来，实验室定向进化技术在生物分子系统的功能设计或再设计方面取得了重大进展，特别是在蛋白质酶的活性和特异性方面进展喜人。在实验室定向进化中，序列突变和重组被密集地推动，然后通过高通量筛选或选择来锁定特定的蛋白质功能。例如，在噬菌体辅助的连续进化(PACE)中，具有修改过的生命周期的噬菌体基因，被用来在细菌宿主细胞之间转移进化，以促进快速复制的噬菌体种群，其中包含对某些有利的酶活性的基因突变。随着定向进化技术的进步，不仅可以设计出具有某些功能的单个蛋白酶，而且还可以对路径或蛋白相互作用网络进行调控或重新布线。同时，基于蛋白质的分子结构和生化特性的蛋白质功能的合理设计一直是人们追求的目标，这通常需要对蛋白质序列或构象演化的高维空间中的最优解进行物理理解和计算探索。由于生物大分子或酶是由高度复杂的结构
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功能关系演变而来的内在复杂系统，直接的物理或理性方法通常具有高度的挑战性，无法得出这种复杂系统的最优解。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法，发现了潜在的物理机制，有望帮助知识/数据学习或合理地重新设计蛋白酶的结构
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功能，以实现重新连接的启动子识别功能。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法，包括以下步骤：(1)模拟野生病毒RNA聚合酶的游离结构，将所述游离结构与含原始识别启动子的dsDNA对接，构建得到封闭启动复合物；
[0006](2)对所述封闭启动复合物进行全原子分子动力学模拟，筛选最佳复合物模型；
[0007](3)参照定向进化实验，对所述最佳复合物模型进行特定突变，得若干不同的RNA聚合酶/启动子复合物；
[0008](4)对所述RNA聚合酶/启动子复合物进行全原子分子动力学模拟，对得到的模拟轨迹进行数据分析，得进化路径的能量学和结构动力学数据，从而得到识别目标启动子的病毒RNA聚合酶。
[0009]优选的，所述病毒包括噬菌体。
[0010]优选的，步骤(1)所述原始识别启动子包括T7启动子，所述dsDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]优选的，步骤(1)所述对接后还包括筛选构建得到所述封闭启动复合物；
[0012]所述筛选包括使用基于FFT的全局对接程序对HDOCK服务器中的推定结合模式进
行全局采样，使用改进的基于形状的成对评分功能，选择得分最好的前10个结构模型，然后将所述前10个结构模型与原始识别启动子RNA聚合酶开放启动复合物进行比对，筛选出与原始识别启动子RNA聚合酶具有相似DNA启动子定位的若干结构。
[0013]优选的，所述全原子分子动力学模拟的每次模拟时长为1微妙。
[0014]优选的，步骤(3)所述特定突变包括利用AmberTools中的Tleap方法改变蛋白质中的氨基酸，将原始识别启动子中的DNA碱基对突变为目标识别启动子中的碱基对，并保持核酸骨架不变。
[0015]优选的，在所述特定突变后还包括对得到的突变产物进行能量最小化处理，得到若干不同的RNA聚合酶/启动子复合物。
[0016]优选的，步骤(4)所述数据分析包括能量计算和氢键盐桥分析。
[0017]优选的，所述能量计算为：利用Gromacs中的g_energy模块，根据含水模型的模拟轨迹重新计算静电和范德瓦尔斯力相互作用，得能量数据。
[0018]优选的，步骤(4)所述目标启动子包括T3启动子。
[0019]有益效果：本专利技术提供了一种基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法，首先为野生型病毒RNA聚合酶(RNAP)构建一个封闭的启动复合物，为从病毒辅助连续进化实验中发现的六个突变型RNAP构建了一个封闭的启动复合物。对这些RNAPs与原始/目标启动子的复合体进行了全原子分子动力学(MD)模拟，每次模拟时间1微秒。本专利技术实施例中模拟结果显示，蛋白质
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DNA的静电相互作用或RNAP
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DNA启动子界面的稳定性很好地决定了RNAP和变体的启动子识别偏好。同时确认关键残基和结构元素对启动子识别的转换有很大贡献：在特异性环上的第一个点突变N748D使RNAP与启动子轻微脱离，阻碍了原来的识别；另一个辅助螺旋(206
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225)在进一步的突变(E222K和E207K)后接管了启动子识别的转换，通过与启动子DNA形成额外的电荷相互作用，在T7和T3启动子上以不同方式重新定向。富含AT的环和特异性环的进一步突变可以将RNAP
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启动子的识别完全转换到T3启动子上。本专利技术基于硅学突变的方法，即利用分子建模和全原子分子动力学(MD)模拟来研究从实验室定向进化发现的病毒RNA聚合酶变体的启动子识别，尤其是利用PACE在类似噬菌体系统中，可以把一个噬菌体RNAP从识别其原始启动子切换到另一个启动子上。
附图说明
[0020]图1为本专利技术基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法流程图；
[0021]图2为Wt
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RNAP和RNAP变体的能量计算在模拟时间上的收敛情况；
[0022]图3为单个残基对RNAP
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启动子静电偏向的贡献；
[0023]图4为单个残基对蛋白质
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DNA结合界面上的相应动态变化；
[0024]图5为氨基酸对RNAP
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DNA启动子识别的贡献。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法，包括以下步骤：(1)模拟野生病毒RNA聚合酶的游离结构，将所述游离结构与含原始识别启动子的dsDNA对接，构建得到封闭启动复合物；
[0026](2)对所述封闭启动复合物进行全原子分子动力学模拟，筛选最佳复合物模型；
[0027](3)参照定向进化实验，对所述最佳复合物模型进行特定突变，得若干不同的RNA聚合酶/启动子复合物；
[0028](4)对所述RNA聚合酶/启动子复合物进行全原子分子动力学模拟，对得到的模拟轨迹进行数据分析，得进化路径的能量学和结构动力学数据，从而得到识别目标启动子的病毒RNA聚合酶。
[0029]在本专利技术的实施例中，所述基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法优选如图1所示，所述病毒优选包括噬菌体，实施例中优选采用T7噬菌体进行说明，但不能仅将其作为本专利技术的保护范围。
[0030]本专利技术模拟野生病毒RNA聚合酶的游离结构，将所述游离结构与含原始识别启动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)模拟野生病毒RNA聚合酶的游离结构，将所述游离结构与含原始识别启动子的dsDNA对接，构建得到封闭启动复合物；(2)对所述封闭启动复合物进行全原子分子动力学模拟，筛选最佳复合物模型；(3)参照定向进化实验，对所述最佳复合物模型进行特定突变，得若干不同的RNA聚合酶/启动子复合物；(4)对所述RNA聚合酶/启动子复合物进行全原子分子动力学模拟，对得到的模拟轨迹进行数据分析，得进化路径的能量学和结构动力学数据，从而得到识别目标启动子的病毒RNA聚合酶。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述病毒包括噬菌体。3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(1)所述原始识别启动子包括T7启动子，所述dsDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述对接后还包括筛选构建得到所述封闭启动复合物；所述筛选包括使用基于FFT的全局对接程序对HDOCK服务器中的推定结合模式进行全局采样，使用改进的基于形状的成对评分功能，选择得...

【专利技术属性】
技术研发人员：鄂超，戴维江，谢潇，郭霞，杨天森，郑善喜，
申请(专利权)人：核工业湖州勘测规划设计研究院股份有限公司，
类型：发明
国别省市：